作者：检验视界
本文刊载于《临床实验室》杂志2022年12月刊“自身免疫性疾病实验诊断”专题-「专家论坛」版块
作者 ：宋佳星 黄晶 单位：吉林大学第一医院检验科
重症肌无力（myasthenia gravis，MG）发病是自身抗体调节的获得性神经-肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）信号途径障碍引起。而MG主要表现为血液循环中出现多种自身抗体，该类抗体能够损伤NMJ终板膜上的乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）功能，降低ACh与受体结合能力，抑制Ca2+内流，从而导致终板膜局部电位不足以集聚引起动作电位，从而影响肌肉收缩，导致肌无力发生。数据显示在医院进行治疗的MG患者中死亡率能达到14.69‰。AChR抗体是目前临床诊断MG的金标准。本文就国内外MG实验诊断技术及临床应用及其进展作一概述。
0 1 MG血清抗体及临床特点
1.1 乙酰胆碱受体抗体
（acetylcholine eceptor antibody，AChR-Ab）
肌肉烟碱型AChR为MG患者中检出率最高的自身抗原，其主要集中在突触后膜折叠部位的尖端。烟碱型AChR可以激活突触后膜上的补体，从而导致AChR的丢失和其特征结构的破坏。其致病机制为：（1）通过激活补体与抗原结合后激活补体级联反应体系，促进相关复合膜形成，诱导攻击抗原-抗体复合物从而引起突触后膜的损伤。（2）通过抗原调节促进AChR内质化，使得抗原交联导致突触后膜上的AChR被破坏。上述机制均可导致突触后膜上AChR识别ACh能力降低，从而阻断AChR信号转导。
MG患者中AChR-Ab阳性检出率高达80~85%，且女性人群检出率更高，该抗体阳性也与胸腺瘤密切相关。AChR-Ab阳性MG患者发病早期主要以眼部症状为主，多于1年内进展为全身型MG且同时伴胸腺组织异常增生。但MG疾病进展与AChR-Ab滴度并无明显相关性。针对于主要的免疫显性区高滴度的AChR-Ab抗体可能与更严重的疾病相关。此外，胸腺瘤患者胸腺切除术后AChR-Ab滴度可降低。在有眼部表现的MG患者中，AChR-Ab滴度的升高能够预测MG泛化的风险。AChR-Ab阳性MG治疗首选乙酰胆碱酯酶抑制剂，而难治性AChR-Ab阳性MG目前尚无有效治疗方案。目前研究方案显示，采用依库丽单抗治疗难治性AChR-Ab阳性MG可有效降低MG危象发生风险。
1.2 肌肉特异性受体酪氨酸激酶抗体
（muscle-specific receptor tyrosine kinase antibody，MuSK-Ab）
肌肉特异性受体酪氨酸激酶（muscle-specific receptor tyrosine kinase，MuSK）可与聚集蛋白结合使乙酰胆碱磷酸化并具有聚集AChR的作用。MuSK-Ab不激活补体，其作用主要是抑制MuSK和胶原Q或LRP4之间的相互作用，通过结合到MuSK的细胞膜外结构从而抑制AChR聚集，引起骨骼肌细胞动作电位阈值增加，最终导致MG的发生。MuSK-Ab阳性MG患者以眼肌无力症且呈亚急性进展为延髓病变为主要表现，但MuSK-Ab阳性MG患者中眼部肌肉功能损伤发生率则明显低于其他MG亚型。在幼儿期MuSK-Ab阳性MG患者可出现广泛的肌肉萎缩，引起患儿肢体和脊柱侧凸，肌肉萎缩在发病早期较为明显，临床上多使用类固醇激素治疗，但部分患者效果不佳可进展为慢性，严重者甚至可导致患儿残疾。
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因MuSK-Ab阳性MG患者较少合并胸腺瘤，因此临床上不建议该类型MG患者行切除胸腺治疗。MuSK-Ab滴度越高患者病情越严重。目前，MuSK-Ab阳性MG患者首选血浆置换及免疫抑制剂治疗，而胆碱酯酶抑制剂治疗效果较差。应用免疫抑制剂他克莫司可有效抑制MuSK-Ab阳性MG患者的CD4+和CD8+ T细胞增殖，减弱致病性Th17细胞分泌IL-17和TFN-γ的能力。
1.3 低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体
（low-density lipoprotein receptor-related protein 4 antibody，LRP4-Ab）
在机体中，LRP4主要集中在神经-骨骼肌接头处，并且可在该处与集聚蛋白形成复合体，复合体可活化MuSK。LRP4-Ab具有破坏LRP4-集聚蛋白复合体的作用从而导致MG。IgG1亚群是LRP4-集聚蛋白复合体的受体，能够有效抑制MuSk活化和AChR的聚集，可见到补体依赖性的细胞坏死，从而导致神经肌肉终板失去相应的信息传递功能。
流行病学调查表明，LRP4-Ab在MG患者中检出率为1~5%，且LRP4-Ab阳性MG患者发病率呈现明显的地理位置差异。LRP4-Ab阳性MG主要多见于儿童及女性人群，此外研究证实LRP4-Ab阳性MG在男性人群中主要表现为迟发性MG。LRP4-Ab阳性MG患者病变起始部位为眼肌，临床症状相对较少，并且不常合并胸腺瘤。在临床治疗方面，患者临床多采用单间酯酶抑制剂和泼尼松治疗，泼尼松治疗的完全缓解率高达41.7%。
1.4 横纹肌抗体
此种抗体包括连接素抗体（Titin-Ab和兰尼碱受体抗体（RyR-Ab））。这些蛋白表达于MG胸腺瘤组织中。Titin-Ab在MG中发病机制可能是通过表位扩展与胞内抗原反应，从而对骨骼肌收缩产生影响。RyR是骨骼肌细胞肌浆网上的Ca2+通道，通过调控Ca2+释放从而参与骨骼肌兴奋-收缩耦联反应，在骨骼肌细胞膜去极化时Ca2+通道开放，大量Ca2+进入细胞质，引起骨骼肌收缩。它们与AChR抗体共同存在于伴有胸腺瘤和晚发性疾病的MG患者中，不发挥直接的致病作用，因为它们的抗原靶点是细胞内的蛋白，但可以作为潜在肿瘤的生物标志物相关。
1.5 集聚蛋白抗体（Agrin-Ab）
集聚蛋白可与骨骼肌纤维膜上的LRP4、层粘连蛋白等结合，调节NMJ的形成、功能维持以及再生。集聚蛋白与LRP4结合为NMJ中信号传导通路中的重要环节，同时集聚蛋白还具有促进MuSK和LRP4间相互作用的功能。研究证实， Agrin-Ab可抑制集聚蛋白与LRP4结合，从而抑制NMJ信号传递功能，导致MG发生。
1.6 其他自身抗体
部分MG患者体内还存在着其他的相关自身抗体，如ColQ-Ab、kv1.4抗体（kv1.4-Ab）及皮质蛋白抗体（Cortactin-Ab）等。ColQ-Ab对ColQ-AchE复合物具有破坏作用，可降低NMJ上ColQ-AchE数量，减少NMJ间隙AchE浓度。而ColQ功能异常可降低对Ach的分解作用，延长Ach活性时间，增加终板电流时间，增强离子内流，从而导致神经肌肉传导受损。Cortactin在NMJ中具有调控肌动蛋白的合成的作用，目前研究认为Agrin/MuSK信号可调控酪氨酸激酶作用于Cortactin，从而激活Agrin在NMJ的聚集和AchR的簇集。
0 2 MG血清抗体的检测技术及新进展
2.1 放射免疫沉淀法
（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）
RIPA是目前检测AchR抗体准确性最高和临床最常用血清学诊断方法。有着非常高的特异性和敏感性，在全身性MG中阳性率约为85% ，在眼部MG中阳性率约为50%，在青春期前儿童（50%- 70%），而在MG并发胸腺瘤患者中阳性率接近100%，已成为MG诊断的金标准。这种方法与ELISA相比灵敏度有极大提高。RIPA可检出约80%的全身型MG患者。其误差产生原因是RIPA所使用的AChR抗原中虽然含有多种亚基，但上述亚基处于游离状态，始终无法与神经-骨骼肌中板膜上的AChR簇集，从而导致一些MG患者采用RIPA无法检出低亲和力的AChR抗体而漏诊。该方法除了定性，也可用于定量检测。主要缺点是具有放射性。
2.2 ELISA
ELISA为实验室中最常用的蛋白检测方法之一。ELISA可以实现全程操作自动化，得到了广泛的应用。但目前该法易受到多种因素的影响：（1）代谢产物：抗原抗体交叉反应是常见的干扰因素之一，导致生物利用度异常；（2）抗体的产生：在蛋白需要定量检测时会导致实验结果出现误差；（3）基质特异性：蛋白在常温条件下的反应性通常会发生变化或蛋白水解，从而影响定量检测结果。导致结果可靠性差。
2.3 荧光细胞染色方法
（cell-based assays，CBA）
CBA是解决RIPA无法检出低亲和力AChR-Ab最佳解决方案。CBA的特点是在细胞膜内外能够检测出那些能与AChR相结合的抗体，因此，当MG患者血清抗体阴性时，CBA能够明显调高抗体阳性检出率。但CBA的缺点在于实验基础要求为活细胞，并且需要专业的组织培养相关设备，除了成本高消耗时间长外，对检查者的要求也较高，从而限制了该方法在临床实验诊断中的应用。
因此Cai等人提出了一个稳定的人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞系（KL525）表达聚集AChR-Ab的研究。在此研究中KL525稳定细胞系检测抗AChR-Ab的阳性结果为80.6%，敏感性比RIPA的51.4%高出29.1%，所有健康个体测试KL525 CBA和RIPA都为阴性，反映此种方式对于低亲和力AChR-Ab敏感性更高。此方法减少了重复瞬时转染而导致的批间偏差，从而提高了检测结果的一致性。此外，稳定细胞系使CBA嵌入微流体芯片成为一种可行的解决方案，为临床提供了节约时间和成本的CBA。
2.4 时间分辨荧光免疫分析法
（time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA）
TRFIA法具有更高的稳定性，可有效克服检测中易出现的反应酶不稳定性高和RIPA放射性污染的问题，但是，该方法对实验设备要求较严格，成为该法在临床中的推广使用的一大阻碍。
0 3 总结与展望
MG临床发病率较低，发病机制复杂，对于自身抗体的血清学检测是MG诊断的核心之一。改良并设计灵敏度高、特异性强，适用性广的检测方法或将成为未来研究的重点。
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题图 | veer.com
排版 | 张宁
审校 | 方研
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