【NIR-II近红外二区成像】近红外二区小动物活体成像在肿瘤诊疗中的应用综述_成像_荧光_肿瘤

摘要

由于具备组织穿透深度深和时空分辨率高等优势, 近年来近红外二区(Near-infrared-Ⅱ， NIR-Ⅱ, 1000~1700 nm)荧光成像技术得到了快速发展, 其在肿瘤临床诊断和治疗的潜力更是引发了广泛关注. 本文首先阐释了NIR-Ⅱ窗口荧光成像的原理及其优势, 随后根据结构分类归纳总结了现有荧光团的特征, 重点介绍了荧光探针在性能优化上的进展以及在肿瘤早期检测、 术中导航和光疗中的应用, 最后讨论了现有NIR-Ⅱ 荧光探针的局限以及临床转化面临的挑战, 并对未来的发展方向进行了展望.

关键词： 近红外二区 ; 荧光成像 ; 活体成像 ; 药物递送 ; 肿瘤诊疗

Abstract

Due to the distinct advantages of deep tissue penetration and high spatial-temporal resolution， near- infrared-Ⅱ（NIR-Ⅱ， 1000—1700 nm） fluorescence imaging technology that developed rapidly in the last decade has attracted extensive attentions for its great potential in tumor diagnosis and therapy. In this review， we first illustrated the mechanism and advantages of fluorescence imaging in the NIR-Ⅱ window. Afterward， the current fluorophores were categorized according to chemical structures， and their properties were introduced respectively. We also highlighted the advances in the development of fluorescence probes and their applications in tumor detection， surgery resection and phototherapy. Finally， we discussed the limitations of current NIR-Ⅱ fluorescence probes and the challenges during clinical translation as well as prospects for future biomedical applications.

Keywords： Near-infrared-Ⅱ ; Fluorescence imaging ; In vivo imaging ; Drug delivery ; Tumor diagnosis and therapy

肿瘤因其高病死率和复发率， 已成为威胁人类健康的重大疾病之一. 由于发现不及时， 很多患者在接受治疗时癌细胞已经转移和扩散， 错过了最佳治疗时机［1，2］. 因此， 肿瘤的早期诊断对于及早干预， 进而提高患者的存活率和生活质量至关重要［3］. 手术切除是目前大部分确诊肿瘤患者的一线疗法， 其需要高分辨率的成像系统辅助， 以准确完整地移除肿瘤病灶， 提高痊愈率， 降低复发风险［4］. 目前， 临床上常用的活体成像技术有磁共振成像（Magnetic resonance imaging， MRI）、 X射线计算机断层扫描（Computed tomography， CT）、 正电子发射断层扫描（Positron emission computed tomography， PET）、 单光子发射断层扫描（Single photon emission computed tomography， SPECT）及超声成像（Ultrasound， US）等. 相比于体外和离体检测方法， 它们能够非破坏性地获得生物组织的微观结构或功能图像， 在早期肿瘤诊断中发挥重要作用［5］. 然而由于这些成像技术的扫描时间通常较长、 灵敏度和时空分辨率较低［6，7］， 并不能有效地检测早期肿瘤， 特别是微小的病变， 也无法很好满足手术导航的需求； 另外， 使用时的辐射也可能会对人体健康造成损害［3，8］. 荧光成像作为一种快速发展的活体成像模式， 不存在电离辐射过程， 无放射毒性， 安全性更高； 且具有较好的成像特性（包括反馈快、 灵敏度高、 检测限低和时空分辨率高［9~11］）. 它能够可视化活体组织和器官的解剖结构和功能， 动态监测肿瘤的病理生理微环境变化［12］， 因此， 有望在肿瘤的诊断和手术引导中发挥重要作用［13］.

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传统的可见光区（400~760 nm）荧光成像深度仅为1~2 mm， 且信噪比低， 难以得到深层组织的复杂生物信息［10，14］. 近红外一区窗口（Near-infrared-Ⅰ， NIR-Ⅰ， 760~900 nm）的出现［15］降低了组织对光的吸收和散射以及组织的自身荧光， 使成像深度大幅提高［14］， 但仍难以满足临床应用的需求［8，14］. 2009年， Welsher等［16］利用单壁碳纳米管首次实现了大于1000 nm的近红外活体荧光成像. 此后， 1000~1700 nm作为第2个近红外成像窗口［近红外二区， Near-infrared-Ⅱ（NIR-Ⅱ）］为人们所熟知［17］. 相较于可见光区和NIR-Ⅰ， 其波长进一步增加， 显著抑制了生物组织对于光子的散射效应， 且生物组织的自身荧光几乎可以忽略不计［18］. 在此窗口进行荧光成像具有前所未有的组织穿透深度（3 cm）和时空分辨率［19］， 在临床应用上比NIR-Ⅰ更有优势［20，21］. 综合考虑水的吸收峰的影响， 得到了两个成像质量更优的亚窗口 NIR-Ⅱa（1300~1400 nm）和NIR~Ⅱb（1500~1700 nm）［22~26］. 已有研究表明光吸收对成像分辨率具有一定的促进效应［27］， Feng等［28］基于此将NIR-Ⅱ窗口进一步扩展至900~1880 nm， 并增加了NIR-Ⅱx（1400~1500 nm）和NIR-Ⅱc（1700~1880 nm）两个亚窗口［图1（A）］， 它们的成像质量相比于NIR-Ⅱa和NIR-Ⅱb有了进一步的提升［图1（B）］.

Fig.1 Illustration of extended NIR⁃Ⅱ imaging window and fo

Fig.1 Illustration of extended NIR⁃Ⅱ imaging window and four sub⁃windows[28]

（A） The light absorption spectrum of water within 700—2500 nm and the exhibition of four sub-windows in NIR-Ⅱ window（NIR-Ⅱa， NIR-Ⅱb， NIR-Ⅱx and NIR-Ⅱc）. The gray arrows represent the absorption peaks； （B） equivalent images of a line source through a bio-tissue of 1 mm thickness in NIR-Ⅱa（1300—1400 nm）， NIR-Ⅱb（1500—1700 nm）， NIR-Ⅱx（1400—1500 nm） and NIR-Ⅱc（1700—1880 nm） after the simulation via the Monte Carlo method.

近年来涌现了许多不同种类的NIR-Ⅱ荧光探针， 研究者们致力于通过结构改造和表面修饰等方法进一步优化其理化性能. 本综述首先剖析了荧光成像的原理， 以及NIR-Ⅱ荧光成像相比于传统成像技术和成像窗口所具有的独特优势， 然后根据化学结构将现有的主要荧光探针分为6类， 分别阐述了它们的特性， 并着重介绍了近年来NIR-Ⅱ荧光成像在性能优化方面的研究进展， 以及在肿瘤成像、 手术导航以及光疗中的应用， 最后讨论了现有NIR-Ⅱ荧光探针的局限及临床转化所面临的挑战， 并提出了未来可能的发展方向.

1 NIR-Ⅱ窗口的荧光成像

1.1　荧光成像的过程

荧光成像的过程包括荧光团的激发、 荧光发射和荧光信号的采集和处理. 当荧光团受到外界光照射时， 若光子的能量恰好为分子某两个能级间的能量差， 则荧光团的核外电子会吸收光子， 从基态跃迁到激发单重态的各个不同振动-转动能级. 处于激发态的分子不稳定， 会通过振动弛豫和内部能量转换回到第一电子激发态的最低振动能级， 再跃迁到基态， 辐射出特定波长的荧光. 由于存在振动弛豫和内部能量转换等非辐射形式， 荧光发射波长总是大于激发光波长， 这一现象称为斯托克斯位移（Stokes shift）. 荧光团发射的荧光经过生物组织的吸收和散射后， 被光学探测器捕获和放大， 最后经过电脑采集处理后得到荧光图像.

荧光团和NIR-Ⅱ成像系统是影响荧光成像的两个重要因素. 荧光量子产率是荧光团的重要发光参数， 它是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比. 通过提高π电子共轭的程度以及分子的刚性， 能够提高量子产率， 同时使荧光发射波长红移. 成像系统的性能对于荧光 图像的效果也很重要. 灵敏度高的成像系统能够有效收集荧光团的发射信号， 提供更准确的解剖结构、 功能和分子图像［25］. 传统的光学探测器为硅电荷耦合装置相机， 检测波段局限于400~900 nm， 对大于1000 nm的光检测灵敏度很低. 近年出现的半导体合金InGaAs和HgCdTe检测器克服了这一局限， 能够实现高灵敏度和高分辨率的NIR-Ⅱ荧光成像［17］， 而更先进的超导纳米线单光子探测器实现了NIR-Ⅱc范围内的细胞分辨水平的共聚焦荧光成像［29］. 近年来， 相继报道了通过整合多功能的模块， 研制出时域多路复用的成像系统［30］和宽谱（400~1700 nm）多路复用的成像系统［31］用于小动物成像的研究. 波长诱导频率滤波的引入使纳米传感器在近红外光谱中的信噪比提高了52倍， 能够检测猪脑颅骨下约2.4 cm处替莫唑胺的化疗活性， 突破了现有纳米感应器体内植入深度的极限［32］. Hu等［20］则用可见光/NIR-Ⅰ/Ⅱ的多光谱成像仪器引导人体的肝肿瘤切除手术， 迈出了NIR-Ⅱ成像临床应用的一大步.

1.2　NIR-Ⅱ荧光成像的特点

大多数临床上的医学成像模式需要通过从物体外部检测到的数据重建物体横截面的信息， 依赖于穿透深度大的辐射以探测成像对象的结构和功能信息［9］. CT用X射线对人体组织进行扫描， 而PET和SPECT使用放射性核素进行成像， 它们都可产生电离辐射， 可危害患者和手术医生的健康. 另外， CT和MRI经常需要高剂量的造影剂， 具有一定的毒性［33，34］. PET成像只显示放射性核素的位置和浓度， 不能对组织结构进行成像， 空间分辨率有限. 传统的成像技术扫描时间都较长， 导致时间分辨率低， 获得的信息准确度有限［6，35］， 且用于分子或功能成像的探针少. 对比之下， 体内荧光成像不存在数据的转换和重建， 能够实时获取图像， 且荧光探针产生的光辐射无害， 在活体器官中具有高的空间分辨率. 此外， 荧光探针的种类相对较多， 既有展现结构的造影剂， 也有提供功能信息的报告基团［9］. 目前临床上的成像系统只能定位肿瘤， 无法可视化特定分子的表达和活动. 而荧光成像的出现使实时观察细胞内信号通路中分子的相互作用、 区分肿瘤细胞和正常细胞成为可能［36］.

相比于可见光和NIR-Ⅰ区， 在NIR-Ⅱ窗口光子与组织相互作用减小， 因此NIR-Ⅱ荧光成像具有深度更大、 分辨率更高的优势. 光与组织具有界面反射、 散射、 吸收和自身荧光4种相互作用［图2（A）］［9］. 吸收和散射主要决定光对组织的穿透深度， 而自身荧光主要影响成像的信噪比和分辨率. NIR-Ⅱ成像的独特优势主要有3点：

Fig.2 Interactions between light and biological tissues in

Fig.2 Interactions between light and biological tissues in visible, NIR⁃Ⅰ and NIR⁃Ⅱ imaging windows[9]

（A） Schematic diagram of the interactions between the photons and tissue in fluorescence imaging； （B） reduced scattering coefficients of different biological tissues and intralipid tissue phantom as a function of wavelength in the range of 400—1700 nm； （C） absorption spectra of oxygenated haemoglobin（red line） and deoxygenated haemoglobin（blue line） through a 1-mm-long path in human blood in visible and NIR-Ⅰ windows； （D） absorption spectra of water through a 1-mm-long path in the range of 400—1800 nm； （E） autofluorescence spectra of ex vivo mouse liver（black）， spleen（red） and heart tissue（blue） under 808 nm excitation light.

（1） 散射作用小. 散射会使光子偏移原来的路径， 降低穿透深度， 生成的杂散光还会增大背景噪音. 随着波长的增加， 不同生物组织的散射系数呈指数性降低［图2（B）］［37］. 可见光区散射作用很大， NIR-Ⅰ区散射作用有所下降， 而在NIR-Ⅱ区， 除脑组织外， 其它组织的散射几乎可以忽略不计， 故具有大的成像深度和信噪比.

（2） 组织吸收小. 生物组织内许多内源分子（如血红蛋白、 黑色素、 细胞色素［9］）具有生色团， 会吸收可见光， 以热的形式耗散， 造成荧光信号衰减. 血红蛋白在可见光区有吸收峰， 而在波长大于700 nm区域对光的吸收几乎为零［图2（C）］. 水在1450 nm处的吸收峰能够减少散射光， 对背景噪音的减少具有一定的积极作用； 其它NIR-Ⅱ成像区域水的吸收都较小［图2（D）］， 信号衰减小.

（3） 自身荧光低. 生物体器官中富含的大多数荧光分子（如还原型辅酶Ⅰ、 黄素、 卟啉类化合物［9，10］）在可见光或NIR-Ⅰ区具有非特异性的荧光发射， 干扰成像结果； 随着波长增至NIR-Ⅱ区域， 各个器官的自身荧光都大幅下降， 在超过1500 nm后几乎消失［图2（E）］， 故具有较高的信噪比.

2 NIR-Ⅱ荧光探针及其在肿瘤诊疗中的应用

荧光团是荧光成像的核心与基础， 通过设计和优化在NIR-Ⅱ窗口成像的荧光团， 可以实现它们 在肿瘤诊疗中的多功能用途. 目前， 具有代表性的NIR-Ⅱ荧光团可根据化学结构分为无机［单壁碳纳 米管（Single-walled carbon nanotubes， SWCNTs）、 量子点（Quantum dots， QDs）和稀土金属纳米颗粒（Rare-earth doped nanoparticles， RENPs）］和有机［小分子荧光探针（Small molecular dyes， SMDs）、 聚集诱导发光材料（Aggregation-induced emission fluorogens， AIEgens）以及共轭聚合物（Conjugated polymers， CPs）］两大类.

2.1　无机荧光探针

不同特性的无机材料制成的荧光团具有不同的光发射原理， 它们一般都具有较大的体表面积和优越的光特性， 发射波长灵活可调， 但也存在生物相容性低及毒性较大等缺点.

2.1.1　单壁碳纳米管

SWCNTs是单层石墨卷曲形成的半导体纳米管， 相邻的碳之间通过sp2杂化， 形成蜂窝状结构［25］. 2009年， Welsher等［16］首次成功将SWCNTs用于体内血管成像. SWCNTs带隙窄［38］， 斯托克斯位移大， 具有宽的NIR-Ⅱ发射谱. 但是其量子产率较低（小于0.4%）， 生物相容性不佳， 因此， 对其进行适宜的功能化以提高荧光量子产率， 降低生物毒性十分关键［39，40］.

通过优化SWCNTs合成的催化剂或在合成后进行分离纯化， 可以缩窄其直径分布， 提高手性纯度， 进而提高其量子产率［41~43］. 另外， 保护SWCNTs免受环境中猝灭剂（酸、 碱、 氧）的影响也是提高其量子产率的重要手段［42，44］. 表面修饰是提高SWCNTs的生物相容性的常用方法， 由于共价修饰会导致量子产率下降， 所以一般将两亲性分子非共价结合在其疏水表面以提高其水溶性. Takeuchi等［45］用磷脂-聚乙二醇（PEG）包裹在掺杂氧的SWCNTs表面， 得到的o-SWCNTs-PEG在体内具有合适的循环和清除时间， 因而毒性低. Welsher等［16］先后进行超声和表面交换， 将二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000（DSPE-mPEG5000）结合在SWCNTs表面， 增加其水溶性的同时提高了量子产率. 此外， Xhyliu等［46］用DNA序列修饰纯手性的SWCNTs［图3（A）］， 一方面DNA的π堆积作用赋予其在水溶液中的高稳定性， 另一方面手性纯度的提高使荧光强度增加［图3（B）］.

Fig.3 Surface modification of SWCNTs for assessing efficac

Fig.3 Surface modification of SWCNTs for assessing efficacy of chemotherapeutics

（A） Surface coating of DNA on a SWCNT by exchange of sodium deoxycholate； （B） enhancement of fluorescence intensity after coating DNA on the surface of SWCNT［46］； （C） change of the endogenous expression of H2O2 measured using photolumines-cence（PL） signals emitted by H2O2 dye and （GT）15-SWCNT； （D） cell viability assay of pancreatic ductal adenocarcinoma cells after exposure to 10 μmol/L gemcitabine treatment at three different time points［49］.（A， B） Copyright 2020， Elsevier； （C， D） Copyright 2019， American Association for Cancer Research.

在肿瘤成像方面， 2015年， Diao等［47］用激光汽化富集得到具有高荧光亮度的半导体SWCNTs， 能在NIR-Ⅱb区域对4T1乳腺肿瘤及其周围血管清晰成像. 近期有研究报道了通过在SWCNTs中掺杂氧， 使其发射波长从980 nm红移到1280 nm， 对子宫内膜癌的成像对比度提高了19.6倍［48］. 除了探测肿瘤， SWCNTs还能用于评估药物的治疗效果. Bhattacharya等［49］发展了一种具有高特异性和敏感性的单链DNA-SWCNTs复合物， 其荧光强度随过氧化氢浓度的升高而降低［图3（C）］， 能够监控吉西他滨诱导产生的具有细胞毒性的H2O2的动态变化， 进而反映肿瘤细胞活性的变化［图3（D）］， 从而监测胰腺导管腺癌的化疗效果.

2.1.2　量子点

量子点（QDs）是三维（3D）的半导体纳米晶体. 基于价带理论， 价带的电子吸收一个能量大于带隙的光子后， 被激发到导带， 接着电子通过弛豫返回价带， 以辐射方式发出荧光［50］. 量子点尺寸较小， 具有突出的光学特性， 包括激发谱宽、 发射谱窄且对称、 量子产率高和光稳定性强［3，51］. NIR-Ⅱ QDs结合了QDs本身的光学优势和NIR-Ⅱ窗口的优势， 能够在深层组织获得极高的时空分辨率， 是理想的成像对比剂. 按照组成的化学元素， QDs可分为Ⅳ-Ⅵ（如PbS）， Ⅰ-Ⅵ（如Ag2S）， Ⅲ-Ⅴ（如InAs）和Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ（如CuInS2）， 其中Ag2S QDs由于不含重金属元素， 具有更好的生物相容性［38，52］.

传统的QDs（如Ag2S QDs）通常具有疏水性表面， 提升其水溶性将有助于其临床应用. 可通过配体交换或表面修饰提高其在水溶液中的分散性和溶解性［51］， 使之更好地用于肿瘤成像. Lu等［52］用正十 二硫醇作为配体， 引入适当比例的油胺和油酸， 提高了Ag2S QDs纳米晶体簇的分散性， PEG化后可 用于小鼠的乳腺癌成像. Awasthi等［53］用聚乙二醇化的聚硫脲树枝状聚合物（PEG-PATU）裹Ag2S QDs［图4（A）］， 能够高效追踪体内A549肿瘤细胞的迁移［图4（B）］.

Fig.4 Water⁃soluble and enzyme⁃responsive QDs achieved by

Fig.4 Water⁃soluble and enzyme⁃responsive QDs achieved by surface modification

（A） The fabrication of PEGylated polyacylthiourea dendrimer（PEG-PATU）-encapsulated Ag2S QDs； （B） the NIR-Ⅱ fluorescence images of the BALB/c mouse at timed intervals after in vivo injection of A549 cancer cells incubated with PEG-PATU Ag2S QDs for 4 h［53］； （C） surface modification of a PbS/CdS/ZnS（core/shell/shell） QDs with fluorescence quenching； （D） the activation process of fluorescent QDs by the enzymatic cleavage of MMP-2 in tumor microenvironment［55］.（A， B） Copyright 2020， the Royal Chemical Society； （C， D） Copyright 2017， American Chemical Society.

除了提高水溶性， 表面修饰策略还可以赋予荧光探针靶向性， 提高其在肿瘤部位的富集. Zhang等［54］将聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）与Ag2Te QDs组装形成PQDs核心， 接着在外表面包裹肿瘤细胞膜， 提高其在肿瘤部位的富集. 用化学修饰的方法能够赋予NIR-Ⅱ QDs响应性特征， 使之与肿瘤部位的特定分子结合后从关闭状态转换成开启状态， 产生荧光. 与传统的荧光探针相比， 它提高了肿瘤与正常组织的信号比. Jeong等［55］报道了具有基质金属蛋白酶2（MMP-2）响应性的NIR-Ⅱ荧光探针， 他们将具有核壳结构的QDs与猝灭剂亚甲蓝通过可剪切多肽连接起来， 由于存在分子内能量转移， 导致 荧光猝灭［图4（C）］， 当结肠癌微环境的MMP-2切除两者之间的连接后， 荧光强度提高到原来的3倍［图4（D）］. 此外， Deng等［56］设计了响应H2S的Ag2S QDs， 并用于结肠癌的准确定位. 肿瘤诊断的方法除了可视化病灶外， 还可以对循环肿瘤细胞进行定量检测. Lian 等［57］制备了三元量子点CuInSe2@ZnS QDs， 不仅能够靶向小鼠肿瘤获得实时成像， 还能定量探测全血中循环的MCF-7乳腺癌细胞. 2022年， Wang等［29］构建了核壳结构的PbS/CdS QDs， 激发波长和发射波长分别为1650和1880 nm， 是迄今小鼠体内成像中最长的单光子激发和发射波长. 此探针在小鼠脑部的成像深度可达1100 µm， 且能够对小鼠腹股沟淋巴结中的免疫细胞进行活体分子成像.

2.1.3　稀土金属纳米颗粒

稀土金属（Rare earth， RE）是元素周期表ⅢB族中钪、 钇和镧系元素的总称. +3价的镧系离子能够发生4f层间的f-f迁移和4f与5d层间的f-d迁移， 产生从紫外到NIR范围的荧光. 稀土金属制成的纳米颗粒（RENPs）通常分为上转换纳米颗粒（Upconverting nanoparticles， UCNPs）和下转换纳米颗粒（Downconverting nanoparticles， DCNPs）两类. 上转换得到的发射光波长小于激发光， 通常在可见光范围内［58］； 而下转换则得到更大的发射波长， 所以大多数NIR-Ⅱ发射都是通过 DCNPs实现的［59］. DCNPs的结构包含稀土金属离子和无机主晶格， 前者包括Nd3+， Tm3+， Pr3+， Ho3+， Er3+ 5种镧系元素， 作用是发射下转换荧光［60］. 而主晶格则为能量从敏化剂转移到掺杂的稀土金属提供晶体环境［61，62］， 其中， NaYF4和NaGdF4使用最广泛. 在现有NIR材料中， RENPs具有发射谱窄， 发射效率高， 光稳定性强和光毒性低等优点［38］， 且其发射波长可调， 在生物成像和成像引导的手术中发挥重要作用［62］.

通过调节掺杂稀土金属的种类和比例能够增大RENPs的发射波长， 提高荧光强度［61］. 以Nd3+作为掺杂剂， 成功获得了能够检测5 mm左右小肿瘤的NIR-Ⅱ发射的荧光探针［63］. Xue等［64］将Er3+掺杂在以NaYF4为核心的纳米棒（NR）中， 并利用亲水的聚丙烯酸（PAA）进行修饰， 得到的PAA-NRs具有NIR-Ⅱb窄带发射， 且具有良好的生物相容性， 能够探测直径约为4 mm的宫颈内小肿瘤. 在此基础上， Li等［65］进一步掺入Ce3+， 抑制了上转换通路， 使下转换的NIR-Ⅱb发射增强［图5（A）］， 不仅能够灵敏地探测原位和转移的小肿瘤［图5（B）］， 还能获得肺癌血管的高分辨率图像（41 μm）［图5（C）］. 另外， 核壳结构也能增强荧光发射强度， 同时增大发射波长［66］. 将掺杂稀土金属和制备核壳结构两种策略结合能使荧光信号提高近9倍［67］.

Fig.5 RENPs applied in tumor imaging after lanthanide dopi

Fig.5 RENPs applied in tumor imaging after lanthanide doping and surface modification

（A） The visible and NIR-Ⅱb luminescence spectra of NaLuF4：Gd/Yb/Er nanorods（Ln-NRs） doped with different contents of Ce3+； （B） optical imaging of primary（site 1） and metastatic（site 2） tumors using poly（acrylic acid）-modified Lu-NRs（PAA-Ln-NRs） as fluorescence probe； （C） magnified tumor vascular image and cross-sectional fluorescence intensity profiles along blue lines 1 and 2 of the tumor site after 10 s intravenous injection of PAA-Lu-NRs solution. The scale bar indicates 2 mm. The white circle indicates the necrosis region in the epidermis of the primary tumor［65］； （D） supramolecular recognition-induced assembly and 980 nm NIR-regulated disassembly of UCNP and DCNP； （E） the two successive injections cause in vivo assembly of azobenzene modified UCNP（UCNP@Azo） and β-cyclodextrin modified DCNP（DCNP@β-CD） with improved tumor targeting. The 980 nm NIR-regulated in vivo disassembly enables rapid clearance in liver. Irradiation of 808 nm lastly was utilized for NIR-Ⅱ bioimaging［69］.（A—C） Copyright 2019， American Chemical Society； （D， E） Copyright 2018， Wiley-VCH.

用生物分子修饰RENPs的表面可进一步提高荧光探针的靶向性. Wang等［68］利用DNA和卵泡刺激素的多肽链修饰NIR-Ⅱ发射的UCNP， 能够提高荧光探针在肿瘤内的富集， 且在NIR-Ⅱ成像引导下可以完全切除直径约1 mm的肿瘤转移灶， 同时提高肝肾清除率以降低体内毒性. Zhang等［59］将肿瘤细胞膜包裹在RENPs上， 以获得肿瘤靶向和免疫逃逸功能. Zhao等［69］通过操控不同的激发光， 控制偶氮基修饰的UCNP和β-环糊精修饰的DCNP的组装和去组装［图5（D）］， 实现纳米探针在肿瘤部位的富集， 降低背景噪音和长期毒性［图5（E）］， 为成像引导的精准肿瘤手术提供支持. 除了赋予荧光探针靶向性以更好地定位肿瘤， 引导手术切除， Li等［70］提供了肿瘤治疗另一种思路： 将脂质体包裹RENPs形成的RENPs@Lip注入荷瘤小鼠的血液循环系统， 能够可视化肿瘤新生血管， 在 NIR-Ⅱ成像引导下进行血管栓塞手术以治疗股骨骨肉瘤， RENPs@Lip还可应用于荷瘤小鼠的前哨淋巴结成像和连续组织活检.

除了无机稀土金属纳米颗粒， 有机配体与稀土金属离子络合形成的配合物在NIR-Ⅱ荧光成像中也具有重要应用， 其具有发射光谱窄、 斯托克斯位移大及光稳定性高等优点［71］. Wang等［72］利用镧系金属Er3+与菌绿素形成配合物， 当配体菌绿素被光激发后， 能够快速地将能量转移到Er3+， 降低了泛频振动导致的荧光猝灭， 在溶液中产生了1530 nm的荧光信号， 这一配合物是多路复用活体成像的有力工具， 能够同时观察小鼠脑部两种荧光标记的肿瘤细胞和血管. Ning等［73］以Yb3+为中心， 卟啉酸盐作为配合物， 构建了一种pH敏感的NIR-Ⅱ荧光探针并用于荧光寿命成像. 这一探针的荧光强度和荧光寿命随pH的上升而增加， 可以用于人宫颈癌细胞中的溶酶体成像以及pH值波动的监测. 此镧系金属配合物还可应用于NIR-II成像引导的小鼠淋巴结定位和活检［74］， 在NIR-II生物成像和外科手术中具有应用前景.

2.1.4　其它无机荧光探针

金纳米簇（Gold nanoclusters， AuNCs）的分子量小、 排泄迅速和生物相容性好［75］. 具有25个金原子和18个多肽配体的纳米簇具有强的NIR-Ⅱ发射［76］. Li等［77］将AuNCs改造成棒状的二十面体， 提高了其量子产率. Song等［78］将AuNCs与环糊精（CD）连接， 形成的CD-Au NCs能够包合抗体， 获得高灵敏度的肿瘤靶向成像. 氧化石墨烯（Graphene oxides， GO）具有良好的生物相容性和独特的表面化学特性， 用其包封掺杂镧系金属的纳米晶体（Ln3+-NCs）， 形成的NCs@GO具有很好的分散性， 能够同时实现肿瘤的NIR-Ⅱ成像和肿瘤细胞追踪［79］. 近期研发的黑鳞量子点是一种新型的NIR-Ⅱ荧光探针， 具有较好的生物降解性以及清除活性氧簇的能力［80］.

2.2　有机荧光探针

无机荧光探针具有未知的长期毒性、 潜在的金属离子泄露和有限的体内清除率， 常常会引发安全性问题， 且它们大多数荧光亮度不够， 难以实现临床转化［81］. 有机荧光团具有完整的分子结构和灵活的衍生性能， 化学和物理特性可调节， 且生物毒性小， 体内生物相容性好［82］.

2.2.1　小分子荧光探针

小分子荧光探针（SMDs）能够被快速代谢排出体内因而毒性低， 拥有良好的生物相容性. 此外， 其结构明确， 光谱特性可调节， 与其它材料相比， 其在NIR-Ⅱ成像中具有更显著的优势［38，83］. NIR-Ⅰ小分子荧光探针吲哚菁绿（Indocyanine green， ICG）和亚甲蓝（Methylene blue， MB）已经被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于临床上眼底血管和淋巴管造影［25］， 在乳腺癌的诊断［84］、 肿瘤切除手术的引导［85］以及泌尿系统的成像［86］中发挥重要作用. 近期发现ICG在大于1300 nm的NIR-Ⅱ区域也有较强的拖尾荧光发射， 意味着它也能应用于NIR-Ⅱ成像， 实现手术引导功能［20，87，88］. 商用染料IRDye 800CW和 IR-12N3与ICG具有相似的特征， 它们的最大发射峰在NIR-Ⅰ区域， 同时具有非常强的NIR-Ⅱ拖尾荧光信号， 因而也能用于NIR-Ⅱ成像. 通过将IRDye 800CW与曲妥珠单抗或PEG连接， 能够对BT474乳腺导管癌细胞及其周围血管成像［87］. Zhu等［89］将具有高量子产率的IR-12N3与抗体连接， 能够靶向鳞状上皮细胞癌， 提高肿瘤与正常组织的信号比， 实现了肿瘤精准定位和手术导航功能.

以ICG结构为基础， 开发了一系列发射峰在NIR-Ⅱ的小分子荧光探针. 如Ding等［90］将ICG聚甲 炔骨架结构中的氮杂环变成氧杂环， 继而使用硫原子取代氧原子， 发射波长和激发波长相继增加， 形成的5H5小分子荧光探针［结构见图6（A）］展现出更高的量子产率和更强的光稳定性， 相比于传统的808 nm激发波长， 1064 nm激发波长下在NIR-Ⅱa区域的肿瘤血管成像的分辨率和信噪比极大提高 ［图6（B）］. 通过在甲炔链引入环己烯基团并在杂环引入取代基， 得到NIR-Ⅱ小分子荧光探针IR-26［91］， IR-1061［92］， FD-1080［93］和Flav7［94］， 它们比ICG的光学稳定性和成像分辨率均更好. Bandi等［95］延长聚甲炔骨架， 并在其上稠合芳环， 得到吸收峰为1072 nm的过磺化吲哚菁染料FNIR-1072. 将FNIR-1072偶联单克隆抗体和右旋糖酐， 使之具有肿瘤靶向性和高的生物相容性， 能够与ICG共同对肿瘤周围淋巴管和血管进行多色活体成像， 展现出很好的肿瘤识别能力.

Fig.6 Two typical SMDs with polymethine backbone and donor

Fig.6 Two typical SMDs with polymethine backbone and donor⁃acceptor⁃donor structure

（A） Chemical structure of 5H5 fluorophore with polymethine backbone； （B） NIR-Ⅱ and NIR-Ⅱa imaging of blood vessels around and within the nude mouse tumors under 808 and 1064 nm lasers［90］； （C） chemical structure of CH1055 with donor-acceptor-donor structure； （D） fluorescent signals for lung metastasis evaluation by CH1055-PEG-Affibody and Hematoxylin and Eosin staining results of part 1， 2， 3， 4 in the lung［102］.（A， B） Copyright 2019， American Chemical Society； （D） Copyright 2019， Wiley-VCH.

氟硼二吡咯（BODIPY）是近年来出现的一类具有高光热稳定性的可见光荧光染料. 在BODIPY核心的3位引入吸电子取代基， 能够使其发射波长红移至NIR-Ⅱ， 和酶的底物偶联后， 能够获得一系列酶响应性的可激活荧光探针［96，97］. Tang等［98］进一步研发了双响应性的NIR-Ⅱ荧光纳米探针（HISSNPs）， 以IR1061作为荧光基团， 透明质酸和二硫键作为双重响应结构， 保持荧光猝灭状态； 只有与肿瘤中过表达的透明质酸酶和硫醇反应后， 才能触发荧光发射. 此探针可以减少非特异性激活， 具有较高的肿瘤与正常组织信号比， 因而能够实现乳腺癌的高特异性成像.

除了以具有聚甲炔结构的ICG为模型研发NIR-Ⅱ小分子荧光探针， 引入电子供体-受体-供体结构也能减小最高占据分子轨道（Highest occupied molecular orbital， HOMO）和最低未占分子轨道（Lowest unoccupied molecular orbital， LUMO）之间的能量间隙， 使发射波长红移至NIR-Ⅱ区域［38］. 大多数具有供体-受体-供体结构的小分子荧光探针以具有强吸电子能力的苯并双噻二唑（BBTD）为核心， 两边是强的供电子基团， 通过芳香性π桥连接［99，100］. 其中， CH1055是典型代表［结构见图6（C）］， 其PEG化后形成的CH1055-PEG是第1个水溶性的小分子荧光探针， 它的肾排泄率大于90%， 具有非常好的信噪比， 在小动物荧光成像中具有很好的应用［101］. 为了使CH1055主动靶向肿瘤， Zhou等［102］将与骨钙蛋白具有相似特性的寡肽PT-7或亲合体化学连接到CH1055上， PEG化后得到NIR-Ⅱ小分子荧光探针CH1055-PEG-PT和CH1055-PEG-Affibody， 前者能够对早期体内143B肿瘤进行NIR-Ⅱ区域高质量成像和引导肿瘤的准确切除； 而后者能够高分辨率地可视化骨肉瘤造成的肺转移［图6（D）］. 改变连接的多肽分子， 能够靶向不同的肿瘤： CH1055连接叶酸时， 能够主动靶向4T1肿瘤， 实现乳腺癌NIR-Ⅱ成像引导下的手术切除［103］； 微小染色体维持蛋白2（MCM2）连接的CH1055能够靶向肝癌组织， 在异体移植的HepG2小鼠模型上获得高对比度和高特异性的肿瘤成像［104］.

虽然供体-受体-供体结构能够增大发射波长， 但长的共轭骨架往往具有较强的分子间相互作用， 激发态的荧光团容易受到周围环境中水等物质的影响， 造成荧光猝灭［81，105］. 为了解决这一问题， 在供体-受体-供体末端引入屏蔽基团（如二烃化合物链）， 增大位阻， 降低分子间相互作用， 防止染料聚集造成荧光猝灭［83，88］， 接着在噻吩基团上引入取代基， 增大供体与受体基团之间的二面角以增强刚性， 进一步提高量子产率［88］. IR-FGP是以CH1055为基础， 通过以上两个策略改造得到的， 其噻吩基团上引入了2-［2-（2-甲氧基乙氧基）乙氧基］乙醇， 并用芴作为屏蔽基团， 同时实现了长波发射和高量子产率［83］. 将小分子有机染料与血浆蛋白络合， 也能提高荧光强度. Antaris等［106］用磺酸基团代替CH1055的羧酸基团， 能够得到具有较好水溶性的NIR-Ⅱ染料CH-4T， 它能与血浆蛋白结合， 形成超分子聚集体， 荧光强度比原来大两个数量级.

2.2.2　聚集诱导发光材料

传统的有机荧光团经常在高浓度或者聚集状态下发生荧光猝灭， 影响成像的结果. 而聚集诱导发光材料（AIEgens）能有效解决这一问题. 其在离散状态下分子内运动活跃， 导致荧光猝灭； 而聚集状态下， 由于分子内运动被限制， 荧光强度大幅增加［图7（A）］［26］. AIEgens能够在相对高的浓度下使用， 光稳定性强， 信噪比高， 且生物安全性好， 能够实现长期的靶向和追踪［107，108］.

Fig.7 Mechanism, strategies of fluorescent properties opti

Fig.7 Mechanism, strategies of fluorescent properties optimization and tumor imaging of AIEgens

（A） The mechanism of AIE through restriction of intramolecular motion at a morphological level［26］； （B） the chemical structure of BPST which is red-shifted compared to an NIR-Ⅰ AIEgen（BPBT） by substitution of a sulfur atom with selenium［112］； （C） the structure of HQL2 and the acquired fluorescence images of U87MG-tumor-bearing nude mice with different filters and exposure times under 808 nm wavelength excitation（90 mW/cm2）［113］； （D） fabrication of TQ-BPN dots； （E） NIR-Ⅱ fluorescence microscopic imaging for visualizing EPR effect in the old and new tumors at different time points. Depth=180 µm. The scale bar indicates 100 µm［114］.（A） Copyright 2020， the authors； （B） Copyright 2019， Wiley-VCH； （C） Copyright 2020， the Royal Society of Chemistry； （D， E） Copyright 2018， Wiley-VCH.

目前， 大多数AIEgens的发射波长小于800 nm［109］， 将发射波长红移至NIR-Ⅱ， 可以整合AIE特征和NIR-Ⅱ的优势， 提高成像质量［110］. 一般策略是将AIEgens设计成共轭的供体-受体结构［111］， 并增强供体的给电子能力或受体的吸电子能力. Wu等［112］用硒原子取代硫原子， 提高了受体的吸电子能力， 得到4，8-双（4-（2，2-双（4-（辛氧基）苯基）-1-苯基乙烯基）苯基）［1，2，5］硒二唑-［3，4-f］苯并［c］［1，2，5］噻二唑（BPST）［图7（B）］， 发射波长增加到1200 nm， 其形成的纳米颗粒用于肿瘤成像和引导手术切除. Li等［113］在间隔基团噻吩的邻位引入十二烷基链， 合成了HQL2［结构见图7（C）］， 其骨架的扭曲程度变大， 能够减少分子内电荷转移导致的荧光猝灭， 同时增强三苯胺的聚集诱导发光效应. 在HQL2表面包裹两亲性分子后形成的纳米颗粒具有高生物相容性， 能够在NIR-Ⅱa和NIR-Ⅱb区域对小鼠脑胶质瘤血管进行高亮度和高清晰度成像［图7（C）］. 同样是利用高强度的NIR-Ⅱ拖尾发射， TQ-BPN AIEgens与普朗尼克F-127形成NIR-AIE-dots［图7（D）］， 可以清晰地可视化肿瘤部位的高渗透长滞留效应（EPR）， 有利于鉴别不同生长时期的肿瘤［图7（E）］［114］.

虽然引入供体-受体结构能使发射波长红移， 但是会导致扭曲的分子内电荷转移， 极大降低了量子产率［115，116］. 为了在荧光团吸收波长红移的同时保留AIE特性， 可以通过抑制扭曲的分子内电荷转移或抑制分子间相互作用， 保持高的量子产率［110］. Qu等［117］将烷基基团连接到Q8P上得到Q8PNap， 使N，N-双烷基氨基转变成季铵盐， 分子平面化， 从而有效地抑制了Q8PNap的扭曲的分子内电荷转移， 使荧光效率提高近10倍， 能够区分原位和转移小肿瘤以及引导手术切除. Liu等［118］在间隔基团噻吩的邻位上引入长的烷基链， 形成2TT-oC6B， 与其异构体2TT-mC6B相比具有更大的扭曲构象， 能够阻止近距离的分子间堆积， 减少分子间相互作用， 因此， 具有更好的AIE属性和更高的荧光量子效率. 还可以通过在供体-受体-供体骨架两端引入四苯基乙烯和三苯胺［26］等能够旋转振动的分子马达， 进一步抑制分子间的相互作用， 使量子产率增加.

2.2.3　共轭聚合物

共轭聚合物（CPs）具有易加工、 光稳定性强及光物理特性可调［119］的优点， 其主链为重复的供体-受体单元， 提高了分子内电荷转移， 降低了聚合物的带隙， 使发射波长红移［120］. 然而， 低带隙使基态和激发态电子的振动存在重叠， 产生非辐射跃迁， 导致其量子产率很低［121］. 另外， 许多共轭聚合物的水溶性较差， 通常需要在其表面包裹两亲性的聚合物形成纳米颗粒， 以应用于生物体内的水性环境. 聚合物纳米颗粒也称为半导体聚合物点（Pdots）， 其含有体积或质量分数大于50%的π共轭聚合物， 直径小于100 nm［122，123］. 与传统的荧光探针相比， Pdots具有吸收横截面大、 发射速度快、 荧光量子产率高和光稳定性强的优点［122］， 近年来在NIR-Ⅱ荧光成像和光热治疗中发挥越来越重要的作用.

通过调节分子内电荷转移， 可以使共轭聚合物同时具有低带隙和高荧光强度. Chen等［124］将不同摩尔比的两种电子受体TTQ和DPP共聚， 得到3种共轭聚合物P1~P3， 由于P1的强吸电子基团TTQ的摩尔比最小， 分子内电荷转移效应最小， 因而具有最大的荧光强度. 表面包裹mPEG-DSPE形成P1纳米颗粒后， 用于4T1荷瘤小鼠的NIR-Ⅱ荧光成像和肿瘤的光热治疗. Zhang等［120］在电子受体噻吩并噻吩（TT）上连接不同长度的噻吩重复单元， 得到TT-T， TT-2T和TT-3T 3个醌式聚合物［图8（A）］. 随着噻吩重复链的延长， 吸电子的侧链基团被稀释， 分子内电荷转移降低， 荧光强度变大. PEG化后形成的TT-3T纳米颗粒荧光信号最强， 在追踪小鼠体内4T1乳腺癌细胞时展现较好的长期稳定性［图8（B）］［120］.

Fig.8 Fluorescence intensity enhancement of Pdots by struc

Fig.8 Fluorescence intensity enhancement of Pdots by structural modification of polymers

（A） Chemical structures of three quinoid conjugated polymers with different lengths of thiophene repeat units； （B） in vivofluorescence images of a mouse at 0， 3， 6， and 10 d after subcutaneous injection with 1×106 of 4T1 cancer cells cultured with a 0.1 mg/mL solution of the TT-3T conjugated polymers（white arrows point to the injection region）. The scale bar indicates 10 mm［120］； （C） schematic illustration of nanoscale fluorous effect to maintain hydrophobic interior and minimize structure distortion of the Pdots； （D） quantitative analysis of cerebral vascular morphology of wild-type C57BL/6 mice and transgenic brain tumors-bearing mice（ND2：SmoA1 mice） imaged by fluorinated Pdots. n=5. The data are analyzed by two-sided Student's t test. Red data are reported as mean ± standard deviation［125］.

（A， B） Copyright 2019， American Chemical Society； （C， D） Copyright 2020， Wiley-VCH.

通过对聚合物单体结构进行改造， 可调节带隙和量子产率等光学特征［123］. Liu等［125］通过在聚合物的受体上引入氟取代基， 增大了有机溶剂中聚合物的发射波长； 表面连接了两亲性的聚苯乙烯-聚乙二醇-羧基（PS-PEG-COOH）聚合物形成Pdots后， 在水性溶液中不仅发射波长红移， 荧光强度也显著增加. 这是由于碳氟单键的引入使Pdots能够维持疏水内部和减少链间相互作用， 同时增加共轭骨架的平面性［图8（C）］， 应用此荧光探针能够辨别野生型和荷瘤小鼠的脑部血管长度、 分支和对称性等血管形态的不同， 进而诊断恶性脑癌［图8（D）］. 而Liu等［126］以喹喔啉（TQ）为电子受体， 在其上不同位置引入烷氧取代基， 合成了聚合物P1~P3， 在苯环3位进行烷氧基取代的P1具有最大位阻， 因而具有最大的红移波长和最高的荧光亮度. 将聚合物P1和PS-PEG-COOH组装， 形成的P1-Pdots具有高量子产率（约1%）， 可用于荷瘤裸鼠的乳腺癌成像和肿瘤血管的监测.

2.3　荧光探针在肿瘤诊疗中的应用

迄今， NIR-Ⅱ荧光探针在肿瘤成像和手术导航方面的应用已经较为成熟. 在肿瘤成像方面， 除了通过优化荧光探针等方法提高单模态NIR-Ⅱ成像的质量， 许多研究致力于将NIR-Ⅱ荧光成像与其它成像模式相结合， 实现整合多种优势的多模态成像. 双模态NIR-Ⅱ/光声成像具有强组织穿透能力、 高时空分辨率和高信噪比， 是脑血管结构成像和脑部微小肿瘤诊断的有力工具. Guo等［127］报道了一种具有高生物相容性和高光稳定性的共轭聚合物纳米颗粒， 能够在NIR-Ⅱ窗口对小鼠脑部同时进行荧光和光声成像， 成功定位了高密度头骨下2.4 mm处的微小脑瘤. NIR-Ⅱ/PET双模态成像结合了NIR-Ⅱ荧光成像高时空分辨率的优点与PET高组织穿透深度的优势， 极大提高了肿瘤成像的效果. Zhang等［128］将NIR-Ⅱ染料CH-4T和放射性核素64Cu装载入脂质体和介孔硅纳米颗粒的混杂体， 形成的NIR-Ⅱ/PET双模态探针具有高荧光强度， 能够获得清晰的肿瘤图像， 具有灵敏的术前肿瘤检测和准确的术中肿瘤切除引导能力. 在手术导航方面， 近期有临床研究利用ICG在NIR-Ⅱ窗口的拖尾荧光发射， 首次对23例肝癌患者进行多光谱成像系统引导的肿瘤手术切除， 证实了其在临床手术导航的巨大潜力［20］. 随着对荧光团性质理解的进一步加深， 已有一些研究尝试将NIR-Ⅱ荧光探针应用于肿瘤光疗. 光疗法主要包括光热治疗（Photothermal therapy， PTT）和光动力治疗（Photodynamic therapy， PDT）. 与传统的放疗和化疗相比， 光疗具有非侵入性、 低毒性和低耐药性的优点， 被认为是传统癌症治疗的重要替代方法［129］. 某些荧光探针由于具有光热转换特性或产生活性氧簇（Reactive oxygen species， ROS）的能力， 能够用于NIR-Ⅱ成像引导的PTT或PDT， 将诊疗一体化， 极大地提高了肿瘤治疗的精准性和有效性［81，130］.

PTT通过光热剂将辐照光的能量转换成热能， 利用局部热量消融肿瘤， 具有很好的肿瘤抑制作用［131，132］. 成像引导的PTT能够实时监控光热剂在肿瘤的累积， 确定最佳的光热治疗时间. Li等［133］将有机小分子荧光探针Flav7与两亲性的多肽结合， 形成NIR-Ⅱ大分子荧光探针. 其血循环时间长， 在肿瘤部位的富集增大； 且光热转换效率（42.3%）高， 具有很好的肿瘤光热切除效应. Zhang等［134］合成了一种新颖的多功能小分子荧光探针SY1080［图9（A）］， 在808 nm激光照射下产生光热效应， 不仅能够消融肿瘤细胞， 还能产生声波， 实现NIR-Ⅱ/光声双模态成像［图9（B）］. Meng等［135］同样利用小分子荧光探针IR1048-MZ实现了NIR-Ⅱ/光声成像和PTT的联合. 除了小分子荧光探针， 共轭聚合物纳米颗粒［136］、 AIEgens［137］、 小分子荧光探针之间有序地错位平行排列形成的J-聚集体［138］也可用于 NIR-Ⅱ成像引导的PTT. Yang等［139］用人血清白蛋白纳米笼限制Ag2S QDs的生长以控制其尺寸， 得到的Ag2S纳米颗粒具有较长的血液循环时间和较高的肿瘤部位富集能力， 且具有较高的光热转化效率（33.7%~35%）， 能够同时实现高灵敏度的NIR-Ⅱ/光声双模态成像和对乳腺肿瘤的光热消融.

Fig.9 Fluorescence probes integrating NIR⁃Ⅱ imaging with p

Fig.9 Fluorescence probes integrating NIR⁃Ⅱ imaging with phototherapy

（A） Synthesis and chemical structure of SY1080； （B） schematic illustration of prepared SY1080 to display its multifunctional PA/NIR-Ⅱ/PTT theranostic effect on tumor-bearing mice with laser irradiation［134］； （C） schematic illustration of RBCp fabrication. With an 808 nm laser irradiation， RBCp can continuously release ICG and O2， which can be applied for NIR-Ⅱ fluorescence bioimaging-guided tumor surgery as well as to enhance the effect of PDT［149］.（A， B） Copyright 2019， American Chemical Society； （C） Copyright 2021， Wiley-VCH.

PDT是利用光敏剂激活后产生的具有细胞杀伤毒性的ROS， 促使肿瘤细胞凋亡和坏死［140~142］. ROS有两种产生途径： （1） 三重激发态的光敏剂直接将电子或光子转移到周围的生物分子中， 产生自由基； （2） 光敏剂将能量转移给三重基态分子氧（3O2）， 产生单线态氧（1O2）［143］. 大多数有机光敏剂的吸收峰限制在600~800 nm之间， 超过800 nm的光子吸收无法提供足够的能量使氧激发到单线态， 从而无法产生足够的ROS［144］， 所以目前临床上的PDT受限于浅表肿瘤［145］. 提高PDT治疗深部肿瘤能力的策略之一是利用UCNP将NIR转换为可见光发射， 而后激活有机光敏剂， 产生ROS. Wang等［146］将表面修饰后的UCNP附着在装载了ICG的红细胞上. 通过静脉注射后， 红细胞能够有效靶向和滞留肿瘤， 在不同的光激发波长下分别实现成像和PDT的功能. 在808 nm激发光下释放ICG和氧气， 发射的NIR-Ⅱ荧光用于成像引导的精确肿瘤切除； 在980 nm激发光下， UCNP通过上转换产生550 nm可见光， 激活光敏剂， 将氧气转换成1O2， 杀死肿瘤细胞， 抑制肿瘤转移［图9（C）］. 然而上转换所需的激光强度高， 往往超过皮肤的耐受阈值， 故开发能够直接吸收NIR的分子材料或许是一种更好的策略. Zhang等［147］设计了尺寸极小的Cu2‒x Se纳米颗粒， 在NIR-Ⅱ激发光下通过电子和能量转移， 能够有效降解肿瘤内的H2O2和氧气， 生成大量的氧自由基， 显著抑制脑部恶性胶质母细胞瘤的生长. Vijayaraghavan等［148］设计的金纳米棘球能够在NIR窗口促进1O2的形成， 在体内同时发挥PDT和PTT治疗效应， 破坏实体肿瘤. 而Gao等［149］在小分子荧光探针的供体-受体-供体结构中引入大位阻基团， 获得了NIR-Ⅱ发射的光敏剂2，2'-（（（（（（苯并［c］［1，2，5］噻二唑-4，7-二基）双（2，3-二氢噻吩并［3，4-b］［1，4］二恶英 -7，5-二基））双（4，1-亚苯基））双（苯氮杂二基））双（4，1-亚苯基））双（甲基亚甲基））二丙二腈（BNET）. 由于扭曲的分子内电荷转移效应， 其发射峰强度极大提高， 克服了长波发射导致1O2产量不足的障碍， 其结合白蛋白形成的纳米颗粒能够对原位结肠癌或胰腺癌的小鼠进行有效的成像引导的PDT.

此外， 研究人员还利用药物递送系统实现抗肿瘤药物与荧光探针的共递送， 将NIR-Ⅱ成像引导的光热治疗与药物治疗进一步结合， 获得更佳的肿瘤治疗效果. Li等［150］设计了一个核心为ICG-RENPs的水凝胶， 在光热介导下的高温环境与富含谷胱甘肽的肿瘤微环境刺激下逐步降解， 释放装载在其中的抗肿瘤药物阿霉素. 这一系统将成像技术、 光热治疗和化疗结合在一起， 能够很好地对肿瘤进行诊断和治疗， 并抑制其转移. Li等［151］将化疗药物培美曲塞、 Nd3+和荧光探针IR825组装成表面类似病毒的纳米药物， 在其表面包裹对酸敏感的PEG壳， 形成纳米球. 在循环血液中， PEG壳能够有效减少免疫系统的清除， 提高系统循环时间. 当移动到肿瘤部位时， 酸性微环境刺激PEG壳脱落， 露出类似病毒的表面， 增大细胞对其的内吞作用， 同时提高在NIR-Ⅱ区域的光热转换效率. 进入细胞后聚集体解体， 释放药物和荧光探针. 在准确的荧光成像引导下， 这一系统能够特异性提高肿瘤的光热治疗及化疗效果， 完整消除肿瘤， 且在单个治疗周期内无复发.

除了与传统的肿瘤治疗手段化疗结合外， NIR-Ⅱ成像还可与分子层面的肿瘤治疗手段（如免疫治疗、 基因治疗和气体治疗［152］）相结合. Liu等［153］将光敏性探针BDP-I-N与两亲性的接枝聚合物自组装形成纳米颗粒， 随后将程序性死亡配体-1（PD-L1）抗体连接在纳米颗粒表面. 一方面光敏剂在808 nm激发光下具有高的1O2产率， 用于光动力疗法消除原位肿瘤. 另一方面， PD-L1抗体能够靶向肿瘤， 提高纳米颗粒在MC38肿瘤中的富集， 进而提高NIR-Ⅱ成像的荧光强度和肿瘤与正常组织的信号比； 其免疫抑制作用能够增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用. 这一纳米颗粒将实时成像、 光动力疗法和免疫治疗三者结合， 使肿瘤在30 d内消除且40 d内无复发， 达到很好的治疗效果. CRISPR/Cas9基因编辑系统是肿瘤基因治疗的重要工具. Li等［154］设计了半导体聚合物簇， 不仅能够递送CRISPR/Cas9， 还能通过NIR-Ⅱ激光下的光热转换控制CRISPR/Cas9质粒DNA的溶酶体逃逸， 使之对特定部位的基因进行编辑， 实现肿瘤的精准治疗. 气体治疗通过CO， NO［155］和H2S［156］等气态分子在线粒体中产生ROS诱导肿瘤细胞死亡， 其副作用极小. Sun等［157］将具有高光热转换效率的共轭聚合物与热响应性的CO供体自组装形成纳米颗粒， 在1064 nm激光下， 不仅能够对MCF-7荷瘤小鼠的脑血管进行高特异性成像， 还实现了光热疗法和气体治疗肿瘤的协同作用.

3 总结与展望

相比传统的临床诊疗影像学技术， NIR-Ⅱ荧光成像作为一种低散射、 深层组织与器官穿透、 高成像分辨率以及无电离辐射危险的活体成像技术， 在肿瘤诊疗领域受到了广泛关注. 本文综合评述了不同结构类型荧光探针的特征， 并归纳总结了优化其理化性能的若干策略. 其主要优化方向为了提升其光学性能（包括发射波长和荧光量子产率）. 无机荧光团光学性能的提高通常需要根据不同的发光机制制定策略； 而有机荧光团多为共轭结构， 通过延长共轭链、 提高电子供体与受体之间的电子推拉作用可增大其发射波长， 增加量子产率则是通过提高分子的刚性和空间位阻来实现. 此外， 为了增强其水溶性及生物相容性， 可以使用表面修饰、 与蛋白质络合以及在分子中引入极性基团等方式. 同时， 许多研究者也设计了具有主动靶向性和生物响应性的荧光探针来提高其成像精准性.

目前， NIR-Ⅱ荧光探针在肿瘤动物模型上的应用已得到了初步验证， 对脑瘤等深层肿瘤的检测能力强且灵敏度高， 有利于肿瘤的早期诊断； 并且其对肿瘤的实时成像效果好， 能够动态观察肿瘤血管的血流状况， 有利于肿瘤的病理研究. 此外， NIR-Ⅱ荧光探针具有术中导航的能力， 能够准确辨别肿瘤与正常组织的边界， 可显著提高肿瘤切除的准确性和有效性.

然而， 现有NIR-Ⅱ荧光探针的种类仍较少， 其成像性能有待进一步提升， 且缺乏高灵敏度的NIR-Ⅱ波段荧光检测器. 临床上使用的荧光剂大多是具有NIR-Ⅱ拖尾发射的NIR-Ⅰ荧光探针（如ICG， OTL38， IRDye 800CW等）. 由于1450 nm处存在能有效抑制背景信号的水的强吸收， NIR-Ⅱx波段具备最佳成像潜力. 将临床现有的NIR-Ⅰ荧光术中导航技术拓展至1300 nm以上的NIR-Ⅱ波段是实现精准医疗关键的一步， 然而目前临床上尚缺少在1300 nm以上有足够发射强度的可用染料， 设计与合成在1300 nm以上具有高效发射能力， 尤其是在1450 nm附近具有高发射强度的小分子染料仍是一大挑战.

其次， NIR-Ⅱ光学探针的生物安全性也是其临床转化面临的一大障碍. 对于无机荧光探针（如量子点）而言， 构建核/壳和核/壳/壳量子点， 以避免重金属离子泄漏或合成不含有毒重金属离子的新型量子点有利于提升量子点的体内稳定性、 生物相容性， 以降低生物毒性. 对于有机荧光探针而言， 全面评估外源性荧光探针的体内吸收、 代谢行为及潜在的长期生物毒性对推动其临床应用至关重要.

此外， 进一步加强基于NIR-Ⅱ荧光成像的抗肿瘤疗法也是未来的重要研究方向. 目前， NIR-Ⅱ成像辅助肿瘤外科手术所用的均为非特异性探针， 可进一步探究不同探针的灵敏度与特异性， 寻找临床应用中针对不同肿瘤的最佳探针. 利用多模态成像手段（如将NIR-Ⅱ荧光宽场显微成像与光声成像结合）可以弥补各自局限性， 破译更多的生物信息， 实现更精准和深入的肿瘤成像. 同时， 利用肿瘤微环境存在的特异性生理信号， 可以实现时间和空间响应性肿瘤成像及靶向精准递药［158］. NIR-Ⅱ成像也可对体中的免疫细胞进行非侵入性成像和跟踪， 可以监测抗肿瘤免疫反应， 有助于优化治疗剂量和治疗时间窗， 为癌症免疫治疗提供新的思路.

通讯作者: 顾 臻, 男, 博士, 教授, 主要从事蛋白质/核酸递药系统、 生物响应材料、 免疫治疗制剂以及细胞治疗研

目前常见的分子影像技术如X-射线成像、断层扫描成像（CT）、磁共振成像（MRI）和超声成像（US）被用于对疾病等的医疗诊断，但这些方法具有较差的空间分辨率及其无法实现动态实时监测等缺点。

传统荧光成像技术存在一个显著的缺点是探测深度相对较低，光子穿透能力受光子在生物组织的吸收以及散射影响，荧光成像的噪音与背景一般来源于生物组织的自体荧光以及光子散射。由于光折射率在微观尺度上存在的不均一性，生物组织体对光具有强散射性，然而这些散射一般随着光的波长增长呈指数性衰减。

近红外二区成像（1000-1700nm）与可见光成像（400-780nm）和近红外一区（780−1000nm）相比，因其在样品中的散射与吸收系数更小，因此具有更高的成像分辨率与穿透深度。近红外二区成像系统针对小动物成像分辨率一般可达30um，能对细小的血管直接成像；穿透深度大致为3cm，即便是小鼠最深的脏器发出的信号也能被检测到。

近红外二区光学成像技术以其高灵敏度、高时空分辨率、信噪比高、成像深度大、自发荧光低、生物损伤小等优点，为微小肿瘤/转移瘤及肿瘤相关血管的检测和研究提供了一种新的无创检测成像手段，在活体成像、疾病诊断、无创治疗、手术导航等领域应用前景广泛。

近红外二区小动物活体荧光成像系统

相机部分：

1、成像模块采用TEC电制冷方式，工作温度达到-100℃；

2、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

3、近红区与可见光区实时同步成像，图像同步精确融合；

4、近红区与可见光区实时同步录像，视频同步精确融合；

激光部分：

1、激发光源采用两种波长（808nm, 980 nm），功率可调；

2、两根液芯匀光光纤分布两侧无死角照射；

3、光纤末端配备准直器，可调激发光的均匀照射；

暗室及控制系统：

1、去除背景，实现成像的平场校正功能；

2、调节红外成像窗宽、窗位功能；

3、荧光寿命成像专用软件模块‘；

4、实现材料长时间的荧光寿命成像；

5、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差极小；

6、多通道气体麻醉，大视野满足多个小动物同时成像；

应用：

适合从事生物学、医学、材料等科研工作者，例如生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、激光光斑分析等领域。

⭐️ ⭐️ ⭐️ 应用案例⭐️⭐️ ⭐️

【案例1】NIR-I区与NIR-II区，成像范围、深度、清晰度对比：

【案例2】近红外二区成像在不通波长下成像比较

通过尾静脉注射PBS溶液中的NM-NPs雌性BALB/c小鼠。用1000LP、1250LP、1400LP滤光片进行160mW cm−2808 nm激光激发，当波长在1000~1400 nm之间变化时，血管的清晰度明显提高，1400LP滤光片NIR-II荧光成像的空间分辨率明显提高，清晰度显著提高。

【案例3】近红外二区成像用于药代释放测试

特定器官和组织中的药物浓度通常用破坏性方法测量，费时费力。针对小剂量毒性药物，可使用功能化的红外探针，与药物接触时发光峰会发生削弱与红移，以实现对药物的检测。将纳米探针放入可长时间存留于生物体内的条形生物膜中，并植入皮下、腹腔内等不同腔室，药物在腹膜内释放后，可检测到内侧纳米探针发光强度减弱与红移。

【案例4】近红外二区成像用于药代动力学监测

临床前药代动力学(PKs)的常用方法为在不同的时间点抽取血液，并通过不同的分析方法对血液水平进行定量。NIR-II可以通过测量麻醉小鼠眼睛和其他身体区域中标记化合物的荧光强度，无创地连续监测血液水平。通过非侵入性眼睛成像测量的血液水平与通过经典方法产生的结果之间有极好的相关性。全身成像显示预期区域(如肝脏、骨骼)有化合物积聚。所以眼睛和全身荧光成像的结合能够同时测量血液PKs和荧光标记化合物的生物分布。

【案例5】近红外二区成像在缺血性脑卒中应用

稀土纳米颗粒（RENPs）是一类稀土离子掺杂的荧光纳米材料，能够在近红外光激发下发射出位于第二近红外区的荧光。且其具有长荧光寿命、窄发射谱带、高光/化学稳定性、低毒性和可调谐荧光发射波长等优势，有望在生物分析和疾病诊断等领域发挥重要作用。利用染料敏化RENPs的复合材料，成功实现了非侵入性、高分辨率脑血管成像，清晰观察到脑血管网络结构及细小的毛细血管结构，并可实时监测生理过程中血液动力学及血管结构的变化。

缺血性脑卒中（Ischemic Stroke, IS）是导致长期残疾以及死亡的主要原因之一，该疾病的严重程度具有时间依赖性，及时评估IS对于该疾病的治疗以及预后起着至关重要的作用。利用比率型近红外二区纳米探针可有效富集在脑缺血病灶位点，可视化氧化应激水平用于及时评估IS。利用近红外二区成像的优势，该探针具有深层的脑组织穿透深度；基于目标物调控染料敏化RENPs发光的原理，该探针对高活性氧物种呈现优异的响应性能。综合以上功能，该探针通过可视化探针在病灶位点的富集程度以及氧化应激水平，在IS发生30min时即可对其进行监测，并评估其严重程度（传统磁共振成像则在IS发生24h才可观察到显著的信号变化）。

【案例6】近红外二区成像用于心肌梗死监测

利用近红外荧光成像的优越采集速度和近红外发射纳米粒子的有效选择性靶向，在急性梗塞事件后仅几分钟就获得了梗塞心脏的体内图像。

【案例7】近红外二区成像用于慢性肝脏疾病无创监测

准非酒精性脂肪性肝病（NAFLD），由于缺乏用于监测炎症和肝纤维化进程的无创方法，肝活检仍是临床诊断NAFLD的金标。非酒精性脂肪性肝病的病理发展中氧化应激是关键驱动力之一，肝损伤和坏死性炎症由驱动纤维化的活性氧簇（ROS, Reactive oxidative species）介导，内源性脂褐素（lipofusion）是ROS的副产物，在808nm激光激发下，能够在近红外范围内被检测到，因此脂褐素的红外成像用于无创评估坏死性炎症活动和纤维化阶段，实现慢性肝病的无创监测。

【案例8】近红外二区成像用于阿尔兹海默症监测

近红外荧光(NIRF)成像已广泛用于临床前研究；然而，它的低组织穿透性对于神经退行性疾病的转化临床成像来说是一个令人生畏的问题。众所周知，视网膜是中枢神经系统(CNS)的延伸，被广泛认为是大脑的窗口。因此，视网膜可以被认为是研究神经退行性疾病的替代器官，并且眼睛由于其高透明性而代表理想的NIRF成像器官。利用CRANAD-X荧光探针标记淀粉样蛋白β(aβ)，并利用成像系统对眼部进行观察可以明显观察到患病前后及治疗前后眼部的荧光强度的差异，进而在未来的人类研究中具有显著的转化潜力，并可能成为未来快速、廉价、可获得和可靠筛查AD的潜在成像技术。

【案例9】近红外二区成像用于体内脂质积累情况监测

细胞中脂质异常积累，通常预示着动脉硬化、脂肪肝等疾病。采用单壁碳纳米管荧光探针，通过近红外发射无创测量细胞中的脂质积累。在注射24 h后，探针富集在肝脏部位，与脂质结合后会使发光峰蓝移，积累越多则蓝移现象越明显，由此实现对脂质的定量检测。该方法可广泛应用于简化药物开发过程，并推动脂质相关疾病的研究。

【案例10】近红外二区成像联合酶激活的纳米探针用于术中进行快速组织病理学分析

准确的分析病理组织是肿瘤手术成功的关键之一，一种可被基质金属蛋白酶(MMP)14激活的NIR-II纳米探针A&MMP@Ag2S-AF7P，可用于体内外神经母细胞瘤诊断和非破坏性的组织病理学分析。

（1）A&MMP@Ag2S-AF7P在正常组织中的荧光可以忽略不计；但是在神经母细胞瘤组织中，其荧光信号会由于过表达的MMP14抑制了Ag2S量子点和A1094之间的荧光共振能量转移(FRET)过程而被快速激活。

（2）与此同时,暴露的膜渗透多肽R9 (TAT-peptide)可以使得该纳米探针被癌细胞有效地内化，进而产生优越的T/N组织信号比值。该探针可以对病灶进行富集定位通过红外二区实时成像描绘出明确的肿瘤边缘，用于癌症手术或组织活检。

【案例11】近红外二区成像指导肿瘤摘除手术

NIR-II成像的高灵敏度可对肿瘤组织进行精准定位。利用靶向NIR-II荧光探针成像并引导进行小鼠头部肿瘤切除手术。实验分两组进行，在完全切除手术后(左二)，选区线扫结果显示病灶部位近红外信号明显减弱，与健康组织相似，在对比实验(右二，人为留下少部分肿瘤组织)中则观察到部分区域仍存在高强度信号，肿瘤组织的切除并不完全，表明NIR-II在肿瘤摘除手术中具有潜在的指导作用。

【案例12】近红外二区NIR-II协同肿瘤光热治疗

纳米粒子(NPs)辅助光热疗法(PTT)是一种有前途的癌症治疗方式，并且已经吸引了科学主流的注意。利用聚集诱导发射(AIE)纳米颗粒和肿瘤细胞来源的“外泌体帽”(TT3-oCB NP@EXOs)制备具有增强的第二近红外(NIR-II，900–1700nm)荧光特性和PTT功能。由于它们在808 nm照射下具有高且稳定的光热转换能力，因此TT3-oCB NP@EXOs可以用作仿生的NPs用于NIR-II荧光成像引导的肿瘤PTT，因此，随着其他靶向性差的AIE纳米粒子的验证，肿瘤细胞衍生的EXO/AIE纳米粒子杂化纳米囊泡可能为改善肿瘤诊断和PTT提供一种替代的人工靶向策略。

【案例13】近红外二区成像测试荧光寿命

⭐️ ⭐️ ⭐️ 案例结束⭐️⭐️ ⭐️

沈阳莫德医药自主研发近红外二区小动物活体荧光成像系统， 性能优异深受用户好评，欢迎您的咨询！

近红外二区小动物活体荧光成像系统