【NIR-II近红外二区成像】NIR-II近红外二区成像-引导肝癌手术肝切除_肿瘤_显像_荧光

【摘要】　目的　探讨吲哚菁绿近红外荧光显像技术在肝细胞癌肝切除术中的临床应用价值。方法采用前瞻性研究方法。收集２０１４年１０月至２０１５年２月解放军总医院临床诊断为肝细胞癌预行肝切除术２４例患者的临床病理资料。术前（２００～１２００ｈ，平均４７５ｈ）给予静脉注射吲哚菁绿（０５ｍｇ／ｋｇ）。开腹暴露并游离肝脏后，手持荧光检测仪器探头，实时可视化显示肿瘤，并引导肿瘤完整切除后，继续对在体剩余肝脏尤其是切缘周围进行探测，将所有疑似病灶进行术中快速冷冻切片病理学检查。对离体肿瘤标本剖面进行荧光成像，结合病理学检查结果进行分析。

观察指标：

（１）术前发现肿瘤的荧光显像检查情况。

（２）荧光显像检查发现新病灶情况。

（３）离体标本肿瘤剖面荧光显像特点。

（４）随访情况。采用电话或门诊随访，术后随访１年，每３个月复查一次增强ＣＴ及相关实验室检查，记录患者复发率和病死率。随访时间截至２０１５年１０月。正态分布的计量资料采用平均数（范围）表示。

结果　

（１）术前发现肿瘤的荧光显像检查情况：２４例患者术前影像学检查发现２４个肿瘤。其中能够在体肝脏表面肿瘤相应投射区域呈现荧光１９个；肿瘤平均深度为０３６ｃｍ（０００～０６５ｃｍ），平均直径为６２０ｃｍ（１２０～９００ｃｍ）。未显现荧光５个，肿瘤平均深度为１５２ｃｍ（０９０～２６０ｃｍ），平均直径为４６０ｃｍ（１５０～７８０ｃｍ）。

（２）荧光显像检查发现新发病灶情况：２４例患者共发现新的疑似病灶１３个，病灶平均深度为０３０ｃｍ（０００～０６０ｃｍ），平均直径为０６５ｃｍ（０２０～１２０ｃｍ），术中快速冷冻切片病理学检查结果证实为肝硬化结节４个、癌３个（高分化１个、中分化２个）、异型增生２个、肝组织炎性改变２个、肝细胞脂肪变性２个。

（３）离体标本肿瘤剖面荧光显像特点：２４例患者的离体标本肿瘤中央剖开，探测剖面均显示很强的荧光。其中１１个高分化肝癌均为肿瘤实质显像，而９个中分化肝癌中有２个属于肿瘤实质显像，７个为肿瘤周围肝组织环状显像，其他４例低分化肝癌则均属于肿瘤周围肝组织显像。

（４）随访情况：术后２４例患者随访１年，无死亡病例，其中３例患者肿瘤复发，平均复发时间为８３个月（５０～１１０个月）。复发患者均进行以外科治疗为主的综合治疗。结论　吲哚菁绿介导近红外荧光显像技术能够在术中显示原发肿瘤部位，同时可探测到术前常规影像检查和术中视、触诊漏检的微小病灶，在提供术中肿瘤准确定位的同时，有助于肿瘤的彻底清除。

【关键词】　肝肿瘤；　吲哚菁绿；　近红外光；　荧光显像；　外科手术

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，目前仍以手术治疗为首选，但存在因漏检微小病灶而导致术后复发的风险。随着精准肝脏外科时代的到来，在肝肿瘤切除术中实施损伤控制和脏器保护的同时，发现微小病灶并彻底清除所有肿瘤是肝脏外科医师追求的目标。近年来，术中超声以其能够准确定位肿瘤、发现新病灶及清晰探查肿瘤与周边脉管系统毗邻关系等优势而广泛应用于肝脏外科手术中［１］。然而其很难发现并诊断直径＜１ｃｍ的肿瘤，对浅表病灶的检出率低以及对病灶良恶性的鉴别能力有限，并且在肿瘤切除过程中不能实时进行手术导航［２］。因此，需要一种新的术中影像探测方法以精确发现肝脏微小肿瘤病灶并对手术操作进行实时导航。

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吲哚菁绿是一种近红外荧光染料，可被波长７５０～８１０ｎｍ的外来光激发，发射波长８４０ｎｍ左右的近红外光。根据其光学特性和生物安全性，临床上已广泛应用于血管、淋巴系统、胆管造影以及肝功能储备检查［３－６］。Ｉｓｈｉｚａｗａ等［７］于２００９年发现肝细胞癌患者术前数天静脉注射吲哚菁绿，术中用近红外显像技术仍可检测到肿瘤组织呈现荧光，使术中肿瘤病灶的实时可视化成为可能。在此基础上，本研究前瞻性分析２０１４年１０月至２０１５年２月解放军总医院肝胆外科医院收治２４例确诊肝细胞癌并预行肝切除术患者的临床病理资料。探讨吲哚菁绿近红外荧光显像技术在肝细胞癌肝切除术中的应用价值。

图１　肝癌肉眼观和荧光显像检查结果　１Ａ：肝包膜下高分化肝癌（）肉眼所见；１Ｂ：肝包膜下高分化肝癌（）荧光显像检查结果；１Ｃ：

肝脏表面中分化肝癌（）肉眼所见；１Ｄ：肝脏表面中分化肝癌（）荧光显像检查结果 图２　离体标本肿瘤剖面肉眼观和荧光显像图

２Ａ：高分化肝癌剖面（）肉眼所见；２Ｂ：高分化肝癌剖面（）荧光显像特点为肿瘤实质显像；２Ｃ：中分化肝癌剖面（）肉眼所见；２Ｄ：中

分化肝癌剖面（）荧光显像特点为周围肝组织显像

１　资料与方法

１．１　一般资料

本研究采用前瞻性研究方法。收集２４例确诊肝细胞癌并预行肝切除术患者的临床资料。男１８例，女６例；年龄３８０～６６０岁，平均年龄５５３岁。病理学检查确诊为肝细胞癌，高分化１１例，中分化９例，低分化４例。２４例患者肿瘤均为单发，共２４个肿瘤病灶，肿瘤平均直径为５４０ｃｍ（１２０～９００ｃｍ），ＨＢｓＡｇ阳性１７例，ＡＦＰ升高１４例。

１．２　纳入标准和排除标准

纳入标准：（１）术前结合影像学检查和实验室检查初步临床诊断为原发性肝癌的患者，术后病理学检查证实为肝细胞癌。（２）肿瘤单发，且无远处转移。（３）符合肿瘤切除的手术指征并成功施行手术。（４）患者性别与年龄不限。（５）肝功能ＣｈｉｌＰｕｇｈ分级为Ａ、Ｂ级。排除标准：（１）胆汁代谢或排泄异常患者。（２）吲哚菁绿过敏或碘过敏者。本研究通过我院伦理委员会审批，批号为Ｓ２０１４０５２０１。患者和家属均被告知参加本研究相关事项并签署知情同意书。

１．３　仪器与试剂

荧光显像系统采用中国科学院自动化研究所中国科学院分子影像重点实验室自主研发的手持式光学分子影像手术导航系统。该系统配有便携式手持手柄，手柄前端探头整合了激发光源发射装置和摄像装置。激发光源可发射７８５ｎｍ左右的激发光；摄像装置能够接收吲哚菁绿分子受激发而发射的８４０ｎｍ左右的近红外光，然后通过数据线传输至主机和电脑，运用专用软件分析数据而获取荧光显像图像。在手术中将手柄探头套上一次性无菌袋保证无菌环境，关闭手术灯（可保留手术室光照），保持探头与肝脏表面距离３０～５０ｃｍ，可采集荧光信号。荧光显像试剂选用丹东医创药业有限责任公司生产的注射用吲哚菁绿，规格２５ｍｇ／支。

１．４　手术方法

所有患者全身麻醉下行肝切除术，于术前（２００～１２００ｈ，平均４７５ｈ）给予静脉注射吲哚菁绿（０５ｍｇ／ｋｇ），并常规进行术前检查、手术规划及术前准备。手术过程：（１）取腹上区反“Ｌ”型切口依次切开入腹，并进行腹腔探查。（２）根据术前影像检查结果及术者视、触诊发现而确定已知肿瘤位置，视情况游离肝脏，采用荧光显像技术对已知肿瘤进行实时可视化定位，记录肿瘤在肝脏表面肿瘤相应投射区域是否能够显像。（３）在实施肿瘤切除术的过程中，对肿瘤进行实时荧光显像定位，引导术者切除肿瘤。（４）切除肿瘤后，对在体剩余肝脏进行荧光探测，将检测到的所有疑似病灶完整切除。（５）将离体标本的肿瘤剖开并进行荧光成像肿瘤实质显像及肿瘤周边组织显像均视为该肿瘤可被荧光显像，反之则视为不可显像。（６）将标本进行常规病理学检查。

１．５　观察指标

观察患者术前发现肿瘤的荧光显像检查情况，荧光显像检查发现新病灶情况，离体标本肿瘤剖面荧光显像特点，随访情况。

１．６　随访

采用电话或门诊随访。术后随访１年，每３个月复查一次增强ＣＴ及相关实验室检查，记录患者复发率和病死率。随访时间截至２０１５年１０月。

１．７　统计学分析

应用ＳＰＳＳ１４０统计软件进行分析，正态分布的计量资料采用平均数（范围）表示。

２　结果

２．１　术前发现肿瘤的荧光显像检查情况

术前影像学检查（Ｂ超、ＣＴ、ＭＲＩ）发现２４个肿瘤。其中能够在体肝脏表面肿瘤相应投射区域呈现荧光的１９个（图１）；肿瘤平均深度为０３６ｃｍ（０００～０６５ｃｍ），平均直径为６２０ｃｍ（１２０～９００ｃｍ）。未显现荧光的５个，平均深度为１５２ｃｍ（０９０～２６０ｃｍ），平均直径为４６０ｃｍ（１５０～７８０ｃｍ）。

２．２　荧光显像检查发现新病灶情况

术前影像已知肿瘤完整切除后，采用荧光显像技术对在体剩余肝脏进行探测。２４例患者共发现新的疑似病灶１３个，病灶平均深度为０３０ｃｍ（０００～０６０ｃｍ），平均直径为０６５ｃｍ（０２０～１２０ｃｍ），术中快速冷冻切片病理学检查结果证实为肝硬化结节４个、癌３个（高分化１个、中分化２个）、异型增生２个、肝组织炎性改变２个、肝细胞脂肪变性２个。

２．３　离体标本肿瘤剖面荧光显像特点

２４例患者的离体标本肿瘤中央剖开，探测剖面均显示很强的荧光。其中１１个高分化肝癌均为肿瘤实质显像（图２Ｂ），而９个中分化肝癌中有２个属于肿瘤实质显像，７个为肿瘤周围肝组织环状显像（图２Ｄ），其他４例低分化肝癌则均属于肿瘤周围肝组织显像。

２．４　随访情况

术后２４例患者随访１年，无死亡病例，其中３例患者肿瘤复发，复发时间分别为术后５０、９０、１１０个月，平均复发时间为８３个月。复发患者均为单个肿瘤，肿瘤距离肝脏表面深度分别约为２００、２３０、２７０ｃｍ，大小分别约为１００、１５０、２３０ｃｍ。肿瘤均进行二次手术予以切除，术后病理学检查结果为均为中分化肝细胞癌。复发患者术后进行以外科治疗为主的综合治疗。

３　讨论

３．１　吲哚菁绿的应用现状

近年来，我国肝细胞癌的发病率居高不下，早期诊断和确切的根治性治疗是决定治疗效果和远期预后的重要环节。肝细胞癌临床治疗过程中，不断进步的影像学技术在很大程度上提高了肿瘤的检出率和切除率，然而目前这些技术仍然很难发现和鉴别微小病灶［８］。随着术中超声在临床上的推广和应用，不仅提高了检出子灶的敏感度和特异度，减少了漏诊和误诊，还能准确定位肿瘤以及探测其与周围脉管系统的毗邻关系，使肿瘤的切除更加完整和彻底［９－１１］。然而术中超声在发现和鉴别直径＜１ｃｍ以下的微小病灶上仍有局限性，对浅表病灶检出较为困难，并且在肿瘤切除过程中也不能实时为术者提供导航［２］。因此，外科手术中肿瘤可视化技术越来越受到关注。

吲哚菁绿作为医学影像显影剂应用于人体已经有５０多年的历史［１２］。吲哚菁绿经静脉进入机体后迅速被肝细胞摄取而使肝脏显现荧光，数小时后几乎全部排泄入胆道，因不进入肠肝循环，肝脏荧光会逐渐减弱至消失［１３］。当肝脏出现癌灶、肝硬化结节及炎性改变等时，相对于周围正常肝组织的快速排泄，病灶处吲哚菁绿滞留而持续呈现荧光［７］。吲哚菁绿被肝细胞摄入是通过两种膜转运系统（ＯＡＴＰ１Ｂ３转运载体和ＮＴＣＰ转运多肽）完成，而其排泄是由毛细胆管侧肝细胞膜上的ＭＲＰ２载体系统实现［１４－１５］。部分肝细胞癌细胞摄入吲哚菁绿的机制正常而排出机制障碍，则吲哚菁绿残留致使肝细胞癌肿瘤实质持续呈现荧光［１６］。自Ｉｓｈｉｚａｗａ等［７］首次报道荧光显像技术导航肝细胞癌切除术以来，在肝脏外科领域荧光显像引导外科医师手术决策的探索研究也越来越多［８，１７－２２］。

３．２　吲哚菁绿荧光显像技术在肝脏手术中的作用

本研究结果显示：荧光显像技术在肝脏肿瘤切除术中确实能够很好地使肿瘤可视化而帮助术者调整手术方式。该技术在肝脏表面即能够显示大部分病灶，术者可根据显像范围确定肿瘤位置及其切除范围。该技术受到探测深度的限制，如本研究中部分病灶不能显像。通过对肿瘤距离肝脏表面深度的测量，笔者发现：荧光显像系统能显示距肝表面较近的浅表肿瘤（深度＜０．６５ｃｍ），而探测不到深度＞０．９０ｃｍ位置较深的肿瘤。有研究结果表明：吲哚菁绿荧光仅能穿透５～１０ｍｍ的肝脏组织［１６］。这与本研究所得结果吻合。虽然Ｍｉｙａｔａ等［１７］运用光声联合成像在一定程度上增加了探测深度，然而仍然没有达到理想的效果。尚需进一步研究提高该技术的灵敏度。

吲哚菁绿荧光显像技术还可对肿瘤切除后在体剩余肝脏进行探测。本研究结果表明：在新发现的疑似病灶中，癌及肝细胞异型增生均予以完整切除。这说明该荧光显像技术除实时显示已知病灶在肝表面的位置，协助判断肿瘤与周围肝组织的分界，还可以发现同时存在的微小病灶，降低肿瘤漏检率，增加彻底清除肿瘤的机会。然而该检测技术仍存在一定假阳性，如肝硬化结节、肝组织炎性改变及肝细胞脂肪变性等，这与肝良性病变内细胞成分微胆管结构紊乱或缺失，吲哚菁绿分子排出障碍有关［２３］。因此，肝硬化严重的患者给荧光显像技术带来了很大的局限性。

３．３　肿瘤荧光显像特点及机制

肝癌的分化程度不同，病灶荧光显像特点也不同。高分化及部分中分化肝癌肿瘤剖面呈现肿瘤实质显像，而大部分中分化和低分化肝癌则呈现肿瘤周边组织的环状显像特点。对此已有的研究结果显示：高分化肝癌细胞仍然具有吲哚菁绿摄取功能，但由于组织内部结构紊乱或排泄通道蛋白表达异常而导致吲哚菁绿排泄障碍，肿瘤细胞内吲哚菁绿沉积而显像［１８］。然而对吲哚菁绿沉积在肿瘤周围肝组织的机制没有明确的解释，可能是因为肿瘤膨胀性生长，压迫周围肝组织致微胆管堵塞导致吲哚菁绿潴留。ｖａｎｄｅｒＶｏｒｓｔ等［１４］最近的研究结果显示：不成熟肝细胞增多以及多药耐药相关蛋白２表达受损也可以导致吲哚菁绿在肿瘤周围肝脏组织沉积。Ｍｉｙａｔａ等［１７］对肿瘤周围肝脏组织显微荧光显像的研究结果支持这个结论。

３．４　荧光显像技术对预后的影响

荧光显像技术能够帮助术者导航肿瘤切除手术并能发现新的病灶，从而提高肿瘤的检出率，调整手术决策，采取相应治疗措施后有望降低肿瘤术后复发率。复发肿瘤均不在肝脏表面以及肝切除断面，这进一步证明在首次肝切除手术中吲哚菁绿荧光显像技术对肝脏切除断面以及肝脏表浅部位的残余肿瘤的高检出率，起到了预防复发的作用。由于吲哚菁绿荧光显像技术探查深度的局限性，其对较深肿瘤复发病灶没有能够起到预防复发的作用。本研究２４例患者术后１年内复发率和生存率分别为１２．５％和１００．０％，而梁宾勇［１９］在研究２６７例单个小肝癌肝切除患者１年复发率和生存率分别为１６．９％和９４．９％。因本研究病例数少且观察期短，在改善预后上仅显示一定的趋势，需要扩大应用以验证其临床价值。

综上所述，利用吲哚菁绿荧光显像系统能够在肝细胞癌肿瘤切除术中清晰显示肿瘤，为术者提供针对肿瘤的实时导航，使肿瘤切除更完整更安全，并且通过发现新的微小病灶而提高肿瘤的检出率，有望进一步降低肝细胞癌术后复发率，改善预后。然而该技术在探测深度和鉴别微小病灶良恶性的方面仍有一定的局限性，有待后续研究和改进。

参考文献

公司简介：沈阳莫德医药科技有限公司，由行业资深人士组成研发团队，专业研发制造近红外二区小动物活体荧光成像系统，有需求随时沟通，欢迎合作。

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相机部分：

1、InGaAs 成像模块采用TEC电制冷方式，芯片工作温度达到-60℃或更低，且芯片工作温度可调；

2、InGaAs成像模块有效像素数量不少于640 x 512，每个像元尺寸不小于15微米；

3、InGaAs成像模块在900-1700nm具有高灵敏度，量子效率不低于70%；

4、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

5、能够实现近红外二区与彩色可见光的实时同步成像，且精确融合图像能够实时展示。

6、近红外二区成像具备过曝光预警功能。成像窗宽窗位可手动自由调节。且具备灰度图像自动增强功能。

7、可见光成像部分具备自动增益，自动曝光，自动白平衡功能，能够自动进行伽马矫正。融合算法先进，用户可以根据需求确定近红外与可见光融合的有效阈值。

8、红外图像、可见光图像和二者融合图像可以同时显示。拍照和录像数据可一键采集，且拍照和录像保存后可再次进行后续数据分析并不失融合。

9、成像参数与激光激发参数能够自动保存。

激光部分：

1、荧光激发光源采用两种波长激光光源（808nm, 980 nm），功率可调且总功率≥20瓦；

2、每种荧光激发光源各采用两根液芯匀光光纤，分布两侧，保证无死角照射。

3、每根光纤末端配备准直器，可调整荧光激发光的均匀照射。

4、可通过系统软件实现激光控制。

5、激光参数自动保存在成像参数中。

暗室及控制系统：

1、标配软件具备成像参数设置功能，如曝光时间、增益、相机工作温度、内外触发等，具备红外成像窗宽/窗位手动和自动调节功能；

2、可通过软件去除背景，实现成像的平场校正等功能；

3、能够实现100μs寿命材料的荧光寿命成像；

4、可同时装载至少5个发射光滤片，标配滤片数量不少于4个；

5、具备荧光寿命成像专用软件模块，可通过软件调节激发光照明时间、相机曝光时间和激发光与相机曝光间隔时间，具有延时成像能力；

6、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差在10μs以内；

7、具备5通道以上小动物气体麻醉功能；

8、能够实现小鼠全身成像和局部成像，视野范围可调，最大视野范围不小于10cm x 8cm；

9、动物载物台可电控升降，行程不小于50cm；

10、动物载物台具有加温保暖功能；

应用：

适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。