【NIR-II近红外二区成像】NIR-II近红外二区成像-三元共聚物光热治疗肿瘤_成像_荧光_聚合物

摘要

为获得同时具有优异的溶解性，高亮度的近红外二区(NIR-Ⅱ，1000~1700 nm)荧光和强的NIR-Ⅱ光热转换能力的共轭聚合物，采用三元共聚策略构建了基于强电子受体和供体的NIR-Ⅱ发射共轭骨架. 在此基础上，进一步通过调控电子给体BDT与2TC之间的比例，得到了一系列具有NIR-Ⅱ吸收和优异溶解性的共轭聚合物(BDT-2TC 12，BDT-2TC 11，BDT-2TC 21). 这些聚合物在700~1200 nm具有较强的NIR吸收，并在808 nm激光激发下表现出在1000~1400 nm区域内的优异NIR-Ⅱ荧光性能. 利用纳米沉积的方法，将目标聚合物BDT-2TC12用两亲性的二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇(DSPE-mPEG)进行包覆，制备得到水溶性良好的纳米粒子(BDT-2TC 12 NPs). 该纳米粒子具有良好的稳定性，在808和1064 nm处均有较强的吸收. 在1064 nm激光照射下，纳米粒子表现出优异的NIR-Ⅱ光热转换效果，可以实现对肿瘤细胞的光热治疗(PTT).在808 nm的激光激发下，纳米粒子还可以实现对小鼠血管和其他生物组织的高清晰度的NIR-Ⅱ荧光成像(FI).

Abstract

In order to simultaneously achieve excellent solubility, high brightness of second near-infrared (NIR-II, 1000-1700 nm) fluorescence, and strong NIR-II photothermal transduction capability of conjugated polymers, we employed a ternary copolymerization strategy to construct the NIR-II emissive conjugated polymers with strong electron acceptor and electron donor in our previous work. In this work, we further adjusted the ratio between the two electron donors, BDT and 2TC, to obtain a series of conjugated polymers, named as BDT-2TC 12, BDT-2TC 11, and BDT-2TC 21. These polymers have strong absorption in the NIR-II region and excellent solubility in organic phase. All of them show strong NIR absorption in the wavelength of 700-1200 nm extended to the NIR-II region and exhibit strong NIR-II fluorescence emission in the NIR-II region of 1000-1400 nm, which was excited by an 808 nm laser. Thereafter, water-soluble and biocompatible nanoparticles (BDT-2TC 12 NPs) were facilely prepared by encapsulating the target conjugated polymer BDT-2TC 12 into the amphiphilic distearyl phosphatidylacetamide-methoxy polyethylene glycol (DSPE-mPEG) through nanoprecipitation method. These prepared nanoparticles have good size-stability and photostability, and exhibit strong absorption at both 808 nm and 1064 nm. Thus, under the irradiation of a 1064 nm laser, BDT-2TC 12 NPs showed an excellent NIR-II photothermal conversion effect (the photothermal conversion efficiency of the BDT-2TC 12 NPs aqueous solution was calculated to be 56.3%), which could realize the photothermal therapy (PTT) of tumor cells. In addition, under the 808 nm laser excitation, the nanoparticles can also achieve high-resolution NIR-II fluorescence imaging (FI) of the mouse blood vessels and other biological tissues.

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译

关键词

高亮度; 共轭聚合物; 1064 nm激光; 近红外二区光热治疗; 近红外二区荧光成像

Keywords

High brightness; Conjugated polymer; 1064 nm Laser; NIR-II PTT; NIR-II FI

译

肿瘤已成为威胁人类健康的第一大“杀手” [ 1~ 3] . 现有的“放疗”和“化疗”肿瘤治疗方法存在药物耐药性和毒副作用大等问题 [ 4~ 6] . 同时，肿瘤的早发现、早诊断和实时跟踪治疗效果对于提高肿瘤的治愈率和术后生存率具有重要作用 [ 7] . 近年来，荧光成像(FI)指导的光热治疗(PTT)，因具有治疗精准度高和非侵入性等特点而受到科研工作者的广泛关注 [ 8~ 11] . 更为重要的是，在外界激光的照射下，具有近红外吸收能力的材料可以单一组分同时实现FI和PTT 2种功能 [ 12~ 16] .

在近红外二区(NIR-Ⅱ，1000~700 nm)波长范围的荧光成像(FI)是一种新兴的光学成像技术，与传统在近红外一区(NIR-I，700~900 nm)的荧光成像相比，它具有更深的组织穿透和更高的成像分辨率，在分子成像领域具有极大的优势 [ 10, 17~ 22] . 目前，一些小分子有机染料和无机纳米材料，如稀土纳米粒子、量子点和碳纳米管，已被广泛用于NIR-Ⅱ荧光成像 [ 23, 24] . 然而，无机纳米材料因重金属引起的毒性而面临潜在的生物安全风险，传统的有机染料则受限于其较差的光稳定性以及有限的肿瘤富集能力 [ 25~ 27] .

有机共轭聚合物由于具有出色的光学特性、良好的生物相容性和分子结构易于调控的特点，在荧光成像和光热治疗领域都表现出巨大的潜力 [ 28~ 34] . 特别是灵活可调的光学特性使得共轭聚合物也被开发用于NIR-Ⅱ FI和1064 nm激光激发的NIR-Ⅱ PTT. 然而，现有报道的NIR-Ⅱ荧光成像共轭聚合物的溶解性和荧光强度均不太令人满意，造成成像质量不理想 [ 30, 35, 36] . 更为重要的是关于同时具备NIR-Ⅱ荧光和NIR-Ⅱ PTT的共轭聚合物的报道的还较少. 因此，迫切需要开发一种简单高效的方法提高共轭聚合物的溶解性，增强NIR-Ⅱ的荧光亮度，最终实现NIR-Ⅱ FI指导的NIR-Ⅱ PTT.

在这里，我们通过三元共聚策略，构建了具有优异溶解性，增强NIR-Ⅱ荧光和具有NIR-Ⅱ PTT的共轭聚合物. 通过三元共聚的方法，选用强电子受体4,9-双(5-溴噻吩-2-基)-6,7-双(4-(己氧基)苯基)-[1,2,5]噻二唑并[3,4-G]喹喔啉(TTQ)和强电子给体4,8-二(4-(2-乙基戊基)噻吩-2-基)苯并[1,2-b:4,5-b']二噻吩-2,6-二基)二(三丁基锡)(BDT)来构建具有NIR-Ⅱ吸收和发射的共轭聚合物骨架，并额外掺杂电子给体5,5'-二溴-4,4'-二癸基-2,2'-联噻吩(TC)，从而提高聚合物的溶解度并实现NIR-Ⅱ荧光亮度的有效增强. 利用二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇(DSPE-mPEG)对聚合物进行包覆以获得水溶性和生物相容性良好的纳米粒子(BDT-2TC 12 NPs). 该NPs在808和1064 nm处均具有较强的吸收，在体外实现了NIR-Ⅱ FI引导的对细胞高效的1064 nm激光激发的NIR-Ⅱ光热治疗，并最终在体内实现了对小鼠血管和肿瘤的高分辨率的NIR-Ⅱ FI.

1 实验部分

1.1 主要原料

4,9-双(5-溴噻吩-2-基)-6,7-双(4-(己氧基)苯基)-[1,2,5]噻二唑并[3,4-G]喹喔啉(TTQ)，(4,8-二(4-(2-乙基戊基)噻吩-2-基)苯并[1,2-b:4,5-b']二噻吩-2,6-二基)二(三丁基锡)(BDT)和5,5'-二溴-4,4'-二癸基-2,2'-联噻吩(TC)购于苏州纳凯科技有限公司. 其他化学催化剂均购自商业途径(如阿拉丁化学试剂公司和西格玛奥德里奇等). 磷酸缓冲液(PBS)、胰蛋白酶消化液和细胞培养基等生物药品均采购于江苏凯基生物科技公司. 采购的溶剂均可直接使用而无需再次提纯.

1.2 聚合物 BDT-2TC S 的制备

1.2.1 聚合物BDT-2TC 21的制备

将TTQ (43.1 mg, 0.05 mmol), BDT (37.26 mg，0.033 mmol), TC (14.08 mg, 0.017 mmol), Pd 2(dba) 3(0.5 mg, 0.0016 mmol), P( o-Tol) 3(2 mg, 0.00218 mmol)和无水甲苯(2.5 mL)加入到10 mL的聚合管中，对整个聚合体系抽真空鼓氮气20~30 min，随后将其放置在油浴锅中，100 ℃下反应，当反应液颜色由黑绿变成灰红时，结束反应. 然后将冷却至室温的反应液用甲醇沉降、抽滤，最后得到黑色固体即为最终产物(产率68%).

1.2.2 聚合物BDT-2TC 11的制备

将TTQ (43.1 mg, 0.05 mmol), BDT (28.23 mg，0.025 mmol), TC (20.7 mg, 0.025 mmol), Pd 2 (dba) 3(0.5 mg, 0.0016 mmol), P( o-Tol) 3 (2 mg, 0.00218 mmol)和无水甲苯(2.5 mL)加入到10 mL的聚合管中，对整个聚合体系抽真空鼓氮气20~30 min，随后将其放置在油浴锅中，100 ℃下反应，当反应液颜色由黑绿变成灰红时，结束反应. 然后将冷却至室温的反应液用甲醇沉降、抽滤，最后得到黑色固体即为最终产物(产率67%).

1.2.3 聚合物BDT-2TC 12的制备

将TTQ (43.1 mg, 0.05 mmol), BDT (19.19 mg，0.017 mmol), TC (27.32 mg, 0.033 mmol), Pd 2(dba) 3(0.5 mg, 0.0016 mmol), P( o-Tol) 3(2 mg, 0.00218 mmol)和无水甲苯(2.5 mL)加入到10 mL的聚合管中，对整个聚合体系抽真空鼓氮气20~30 min，随后将其放置在油浴锅中，100 ℃下反应，当反应液颜色由黑绿变成灰红时，结束反应. 然后将冷却至室温的反应液用甲醇沉降、抽滤，最后得到黑色固体即为最终产物(产率68%).

1.3 BDT-2TC SNPs 纳米粒子的制备

分别将共轭聚合物BDT-2TC S溶于四氢呋喃(THF)中，搅拌2 h，配成0.5 mg/mL的有机溶液. 将两亲性聚合物mPEG-DSPE溶于去离子水中，超声溶解配成1.0 mg/mL的水溶液. 在持续超声条件下，用注射器快速将1 mL BDT-2TC S有机溶液快速加入10 mL DSPE-mPEG水溶液中，超声8 min后，用氮气鼓泡除去THF. 彻底除去THF后得BDT-2TC S NPs水溶液，其外观为澄清棕红色溶液.

1.4 表征与测试

利用Shim-pack GPC-80X型号的凝胶渗透色谱(GPC)测定聚合物分子量，以色谱级的THF为洗脱液，流速为1.0 mL/min，标样为聚苯乙烯. 在ALV/CSG-3上进行动态光散射(DLS)表征，测试温度为25 ℃，固定散射角度为90°；透射电子显微镜(TEM)图通过HT-7700型透射电子显微镜上测定，制备样品时将BDT-2TC 12纳米粒子水溶液滴至铜网上，使其自然风干. 利用Shimadzu UV-3600 Plus UV-Vis-NIR光谱仪测定吸收光谱(UV-Vis)；荧光光谱(PL)在Horiba Fluorolog 3型近红外二区荧光光谱仪(配置有In Ga As近红外检测器)上测试获得，荧光成像通过近红外二区活体成像仪(Wuhan Grand-imaging Technology Co.，Ltd)获得激光器用808 nm和1064 nm半导体激光器(长春新工业光电科技有限公司)；光热成像测试在近红外热成像仪(Fotric 225，±2 °C，上海 Fotric).

1.5 体外 BDT-2TC 12NPs 的光热转化性质

为了研究纳米粒子BDT-2TC 12 NPs的光热转化性质，首先配置不同浓度(0.1、0.08、0.04 mg/mL)的纳米粒子水溶液，取200 μL的PE离心管装入150 μL. 用1064 nm的激光器以1 W/cm 2对纳米粒子进行照射，每隔30 s记录温度的变化，形成升温曲线，照射6 min后，温度上升到平台期，获得BDT-2TC 12 NPs不同浓度的升温曲线.

为了测试BDT-2TC 12 NPs的光热转换效率，将150 μL (0.1 mg/mL) BDT-2TC 12 NPs水溶液移到200 μL的透明PE离心管中，再用1064 nm的激光器以1 W/cm 2的功率对离心管的中心进行持续照射，待温度升至最高温度保持1~2 min不变时，关掉激光器，让离心管中溶液的温度自然下降，直至恢复室温，然后再打开激光器重复上述操作5次. 通过近红外热成像仪的内部软件导出数据，每隔30 s选取1个温度，可获得BDT-2TC 12 NPs的升温曲线、升降温曲线和循环曲线. 最后，BDT-2TC 12 NPs的光热转换效率通过 公式(1)和 公式(2)计算得出.

其中 h、 S、 T max、 T min、 Q dis、 I和 A 1064分别是系统的表面积、传热系数、系统的平衡温度(激光照射时达到的最高温度)、环境温度、样品瓶和溶剂吸收的热量、系统吸收的总能量和材料在1064 nm处的吸光度.

另外，参数 τ s是样品系统的时间常数. 参数 m D和 C D分别是溶剂的质量和比热容.

1.6 体内血管 NIR-Ⅱ荧光成像

研究BDT-2TC 12 NPs对在体内对小鼠血管荧光成像时，首先配置2 mg/mL的BDT-2TC 12 NPs水溶液，通过尾静脉注射的方式将材料注入小鼠体内，并立即利用成像仪对小鼠进行整体荧光成像，在小鼠全身血管成像后，换用高倍(50×)镜头，相同条件下对小鼠的脑部和腹部进行局部成像.

1.7 BDT-2TC 12NPs 的体外细胞毒性检测

用MTT法测试BDT-2TC 12 NPs的细胞毒性.首先在PBS缓冲溶液湿润后的96孔细胞培养板中加入消化好的HepG 2细胞，按照每孔100 μL的量(细胞数约2×10 4)加入到96孔板中，轻摇使细胞均匀，在37 ℃和5%的CO 2的条件下同含有10% FBS的完全培养基共培养24 h.细胞贴壁生长后，换掉培养基，加入配制好的不同浓度的目标材料，再次培养24 h，然后用MTT溶液(5 mg/mL)换掉材料，培养4 h后，加入100 μL DMSO溶液，震荡摇匀后，用酶标仪检测仪检测490 nm处的吸收以评价BDT-2TC 12 NPs的细胞毒性.

在进行光毒性检测时，在纳米粒子和细胞共培养4 h后，吸出溶液，每孔加入100 μL的含有纳米粒子的DMEM不完全培养液，用1064 nm的激光器以1 W/cm 2的功率照射5 min，吸出不完全培养液，加入新鲜的DMEM不完全培养液，置于培养箱中，继续培养24 h后，用MTT溶液(5 mg/mL)换掉材料，培养4 h后，加入100 μL DMSO溶液，震荡摇匀后，用酶标仪检测仪检测490 nm处的吸收.

1.8 BDT-2TC 12NPs 的肿瘤 NIR-Ⅱ FI

健康的BALB/c裸鼠(年龄5~6周)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；将HepG2细胞(4×10 6)悬浮于50 μL的PBS中，再将该细胞悬浮液皮下注射进小鼠的左腋处，可得携带HepG 2肿瘤的荷瘤鼠模型，肿瘤体积约以倍速增长，体积计算公式为 V= 0.5 LW 2，其中 L和W分别代表肿瘤的纵向直径和横向直径；当小鼠肿瘤体积长到100 mm 3时，即可应用于活体成像实验.

将200 μL配制好的BDT-2TC 12 NPs水溶液(2 mg/mL)通过尾静脉的方式注射到实验小鼠体内，利用近红外二区荧光成像仪对其进行实时的全身血管和肿瘤的高分辨成像. 异氟烷麻醉老鼠后，将其仰面固定在近红外二区荧光成像仪里进行实时NIR-Ⅱ荧光成像，其中激光波长为808 nm，半导体激光器的输出功率为200 mW，滤光片为1064 nm长通滤光片.

2 结果与讨论

2.1 共轭聚合物 BDT-2TC S 的合成与表征

通过系统地改变2个电子给体单元(BDT和2TC)的比例以获得一系列具有NIR-Ⅱ吸收和发射共轭聚合物(BDT-2TC S). 从 图1(a)的合成示意图可以看出，BDT-2TC S由强电子给体BDT和强电子受体TTQ通过Stille偶联聚合得到. 通过将另一种电子给体2TC掺入聚合物主链中，合成具有不同掺杂比的共轭聚合物(BDT-2TC 12，BDT-2TC 11，BDT-2TC 21). 通过使用凝胶渗透色谱(GPC)，对聚合物分子量及其分布(PDI)进行表征. 如图 1(b)~ 1(d)所示，通过GPC数据可知聚合物BDT-2TC 12、BDT-2TC 11和BDT-2TC 21的数均分子量 M n分别为2.5×10 4、2.8×10 4和2.6×10 4，分子量分布PDI分别为1.6、1.5和1.7.

Fig. 1

Fig. 1 (a) Synthetic routes to organic conjugated polymer BDT-2TC S. GPC curves of (b) BDT-2TC 12, (c) BDT-2TC 11, and (d) BDT-2TC 21.

合成得到的共轭聚合物BDT-2TC 12、BDT-2TC 11和BDT-2TC 21在常见的有机溶剂(如二氯甲烷、四氢呋喃(THF)和甲苯)中有着良好的溶解性. 通过紫外可见光光谱仪和荧光光谱仪，对具有不同BDT和2TC掺杂比的聚合物在THF溶剂中的吸收和荧光发射进行了表征. 如 图2所示，所有聚合物在NIR-I (808 nm)和NIR-Ⅱ(1064 nm)区域同时具有较强的吸收并在NIR-Ⅱ区域具有较好的发射，表明这些聚合物可用于制备纳米诊疗剂，实现808 nm激发的NIR-Ⅱ FI及其介导的1064 nm激发的NIR-Ⅱ PTT. 从 图2(a)可知，随着BDT和2TC掺杂比的增加，聚合物的吸收峰表现出明显的蓝移现象，吸收主峰从900 nm (BDT-2TC 21)蓝移至891 nm (BDT-2TC 12)，但聚合物在1064 nm处都有较强的吸收. 同时，从 图2(b)的荧光光谱图中看出，当把3种聚合物在808 nm处的吸收值调至OD值均为0.13时，在808 nm激光激发下，随着掺杂比的增加，BDT-2TC 12表现出在发射主峰(1052 nm)处最高的荧光强度，分别是BDT-2TC 11荧光强度的1.23倍和BDT-2TC21的1.20倍. 图2(c)是3种共轭聚合物的THF溶液在明场下拍摄的图片，可以看出，BDT-2TC 12在THF溶剂中较其他2种聚合物具有更好的溶解性(2 mg/mL). 图2(d)是聚合物THF溶液的NIR-Ⅱ荧光成像照片，同样地，BDT-2TC 12表现最强的NIR-Ⅱ信号，证明它更具潜力实现在NIR-Ⅱ区域高亮度的FI.

Fig. 2

Fig. 2 Absorption spectra of (a) the BDT-2TC S with the same absorbance at 808 nm and their corresponding fluorescence spectra (b) under 808 nm laser excitation. (c) Bright field images and (d) NIR-II images of BDT-2TC S in THF solution. Absorption spectra of (e) the BDT-2TC S NPs with the same absorbance at 808 nm and their corresponding fluorescence spectra (f) under 808 nm laser excitation.

2.2 水溶性纳米粒子 BDT-2TC SNPs 的制备与表征

为了制备水溶性纳米粒子以进一步实现成像和光热治疗应用，我们通过纳米沉积的方法将这些聚合物用二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-甲氧基聚乙二醇(DSPE-mPEG)进行包覆，最终得到3种水溶性良好的共轭聚合物纳米粒子(BDT-2TC 12 NPs，BDT-2TC 11 NPs，BDT-2TC 21 NPs). 这些水溶性的纳米粒子(0.05 mg/mL)具有与BDT-2TC 12、BDT-2TC 11和BDT-2TC 21在有机相中类似的吸收峰和发射峰. 由于纳米粒子内共轭聚合物的聚集，纳米粒子表现出比在有机相中略微红移的吸收峰，主要集中在700~1200 nm ( 图2(e)). 当把这3种纳米粒子在808 nm处的吸收值调至OD值均为0.3时，它们的NIR-Ⅱ荧光发射强度表现出与对应聚合物在有机相中一致的趋势. 如 图2(f)所示，BDT-2TC 12 NPs表现出最高的NIR-Ⅱ荧光强度. 更为重要的是，BDT-2TC 12 NPs在NIR-Ⅱ区域显示了在914 nm处的最大吸收峰，并在1064 nm处有较强的吸收，从而允许在1064 nm激光照射下实现NIR-Ⅱ光热治疗.在808 nm激光激发下，其荧光光谱显示在1272 nm处有最大发射峰，证明BDT-2TC 12 NPs具有优异的NIR-Ⅱ荧光成像能力.

因此，我们选择具有最佳光学性能的BDT-2TC 12 NPs来进一步研究其在细胞治疗和活体肿瘤成像等方面的应用. 从 图3(a)的动态光散射仪(DLS)数据图中可以观察到BDT-2TC 12 NPs的流体力学直径(< D h>)为104 nm，粒径分布较窄(PDI=0.202). 图3(b)的透射电子显微(TEM)图显示纳米粒子均匀规则的球形结构，直径约为93 nm，与DLS结果基本一致，表明BDT-2TC 12 NPs具有很好的分散性和均一性.鉴于BDT-2TC 12 NPs在1064 nm处有较强的吸收，继续测试了该纳米粒子水溶液在NIR-Ⅱ光源(1064 nm)激发下的光热效应. 如 图3(c)所示，在1064 nm激光(1 W/cm 2)照射下，BDT-2TC 12 NPs表现出浓度依赖性的升温现象. 特殊地，在对BDT-2TC 12 NPs (0.1 mg/mL)连续照射5 min后，其温度上升到70 ℃，最大温度差达到42 ℃. 而用1064 nm激光照射纯水时，温度仅上升到35.3 ℃，温差仅在5 ℃以内. 图3(d)显示对BDT-2TC 12 NPs进行多次循环光照，发现其具有很好的热稳定性. 根据BDT-2TC 12 NPs和纯水的升温和降温曲线以及响应的拟合数据，我们计算得出BDT-2TC 12 NPs的光热转化效率高达56.3%. 这些结果证明BDT-2TC 12 NPs在1064 nm激光激发下具有良好的光热效果并有潜力实现NIR-Ⅱ PTT.

Fig. 3

Fig. 3 (a) The hydrodynamic diameter and (b) TEM image of BDT-2TC 12 NPs. (c) Temperature changing curves of various concentrations of BDT-2TC 12 NPs solution under 1064 nm laser at the power density of 1 W/cm 2. (d) Thermal cycling of BDT-2TC 12 NPs solution.

2.3 BDT-2TC 12NPs 在体外的光热治疗

要实现BDT-2TC 12 NPs在体内优异的NIR-Ⅱ光热治疗效果，首先需要其具有良好的生物相容性.通过MTT法评估了BDT-2TC 12 NPs的细胞毒性. 如 图4(a)所示，将BDT-2TC 12 NPs与HepG 2肿瘤细胞和正常的3T3细胞在不同浓度下分别共培养24 h，HepG 2肿瘤细胞和正常的3T3细胞均保持好的细胞活性，证明BDT-2TC 12 NPs具有好的生物相容性.

Fig. 4

Fig. 4 (a) In vitro cytotoxicity of BDT-2TC 12 NPs incubated with HepG 2 and 3T3; (b) Cell viabilities of HepG 2 cells under the incubation with BDT-2TC 12 NPs at different concentrations without or with 1064 nm laser irradiation (1 W/cm 2 ); (c, d) Fluorescence images of live (green) and dead (red) HepG 2 cells co-stained with calcein-AM and propidiumiodide after different treatments.

NPs对肿瘤细胞的光热治疗效果. 选用常用的肺癌HepG 2细胞，设计2组实验，其中对照组只是将HepG 2细胞和BDT-2TC 12 NPs进行共培养，不做任何处理，而实验组是在与细胞共培养4 h后用1064 nm的激光以1 W/cm 2的功率对HepG 2细胞进行光照处理5 min，通过MTT实验测试细胞的活性. 结果如 图4(b)所示，从图中可以发现，在NIR-Ⅱ光激发下，随着BDT-2TC 12 NPs浓度的增加，细胞活力逐渐降低，在0.2 mg/mL的浓度下，细胞杀灭率高达81%. 相比之下，在没有光照的情况下，即使在相对较高的BDT-2TC 12 NPs浓度(0.2 mg/mL)下也未检测到明显的细胞毒性，证明了BDT-2TC 12 NPs的细胞毒性较低. 此外，我们进一步进行了HepG 2细胞的钙黄绿素乙酰氧基甲基酯/碘化丙啶染色，以直观地反映BDT-2TC 12 NPs的优异NIR-Ⅱ PTT性能. 实验组的细胞几乎完全被红色荧光(代表死细胞)染色，而对照组的细胞则完全被绿色荧光(代表活细胞)染色，结果如 图4(c)和4(d)所示. 这些结果证明在NIR-Ⅱ光的辅助下，BDT-2TC 12 NPs具有高的细胞杀伤效率.

2.4 BDT-2TC 12NPs 的 NIR-Ⅱ FI

考虑到BDT-2TC 12 NPs具有优异的NIR-Ⅱ荧光性质，首先测试了该NPs对健康小鼠血管的NIR-Ⅱ FI. 在尾静脉注射BDT-2TC 12 NPs 10 min后，通过808 nm的激光器和1064 nm的长通滤光片，小鼠全身的血管就可以被清晰地看见( 图5(a))，这是由于NIR-Ⅱ区域的光具有较深的组织穿透能力. 从 图5(b)和5(c)的局部血管放大图中可以清晰地看见腹部与后肢血管的脉络，具有较高的空间分辨率. 如 图5(d)和5(e)所示，通过ImageJ图片处理软件对目标进行量化分析，研究得到腹部和后肢的血管信号与组织信号对比的成像信号比分别高达7.6和18. 这些结果都有力证明了BDT-2TC 12 NPs具有优异的荧光性能，可实现高分辨率的活体荧光成像.

Fig. 5

Fig. 5 (a) NIR-II fluorescence image of healthy mice body injected with BDT-2TC 12 NPs (150 μL, 1 mg/mL, 500 ms). The vasculature of enlarged (b) abdomen and (d) hind limb and (c, e) their corresponding normalized fluorescence intensities of the cross-sectional profiles along the red dotted lines with signal-to-background ratio (SBR) analysis.

2.5 BDT-2TC 12NPs 在体内的光诊疗

为了探索BDT-2TC 12 NPs在体内进行NIR-Ⅱ光热诊疗的可行性，首先在异种移植的HepG 2肿瘤模型中研究了BDT-2TC 12 NPs辅助的NIR-Ⅱ肿瘤荧光成像，以证明其能为PTT提供指导.在通过尾静脉注射BDT-2TC 12 NPs (2 mg/mL，200 μL)后，随着时间的推移，通过NIR-Ⅱ活体成像仪可以观察到来自肿瘤区域的NIR-Ⅱ荧光亮度逐渐增强，成像结果如 图6(a)所示. 在注射后24 h达到信号最大值，此时肿瘤处的信号强度值与背景信号相比，显示出8.1倍的信号增强. 该结果证实BDT-2TC 12 NPs通过被动靶向能够成功地积累到肿瘤组织，这为肿瘤的光热治疗提供了最佳治疗时间( 图6(b)).

Fig. 6

Fig. 6 (a) In vivo NIR-Ⅱ images of mice after i.v injection with BDT-2TC 12 NPs; (b) The photothermal images and temperature curve of the tumor site under laser irradiation; (c) The tumor volume growth curves of different treatment groups (BDT-2TC 12 NPs+laser, PBS+laser ); (d) Tumor temperature extracted from the mice in different treatment groups.

在NIR-Ⅱ FI指导下，在注射BDT-2TC 12 NPs后24 h的最佳治疗时间点，对肿瘤进行了1064 nm激光的光热成像. 将荷瘤鼠分为2组：(a)尾静脉注射PBS，(b)尾静脉注射BDT-2TC 12 NPs，在连续激光照射下(1064 nm，1 W/cm 2)的同时通过热成像仪记录肿瘤处的温度变化以及进行热成像. 如 图6(c)所示，用BDT-2TC 12 NPs处理的小鼠的肿瘤温度显著升高，并迅速达到70 ℃，持续5 min ( 图6(c)和6(d))，该温度足以杀死肿瘤组织. 相比之下，“PBS+NIR-Ⅱ”组中肿瘤部位的温度在激光激发5 min后才达到35.3 ℃. 综合上述实验结果，证明了BDT-2TC 12 NPs有能力实现明亮的NIR-Ⅱ FI引导的高效的NIR-Ⅱ PTT.

3 结论

本文设计合成了一系列同时具有优异溶解性，明亮NIR-Ⅱ荧光以及强的NIR-Ⅱ光热转化能力的共轭聚合物BDT-2TC S. 通过调控强电子基团BDT和2TC的比例，得到性能最优溶解性最好的聚合物并制备成纳米粒子BDT-2TC 12 NPs. 该纳米粒子具有良好的稳定性并在808和1064 nm处均具有较强的吸收. 体外的细胞实验证明BDT-2TC 12 NPs具有优异的NIR-Ⅱ光热性能，可以在1064 nm激光照射下实现对肿瘤细胞的光热治疗. 同时在体内的活体实验进一步证明了改纳米粒子在808 nm激光照射下有能力实现对小鼠血管高清晰度的NIR-Ⅱ荧光成像.

参考文献

1 Chen H, Zhang W, Zhu G, Xie J, Chen X . Nat Rev Mater, 2017, 2: 17024. doi: 10.1038/natrevmats.2017.24

2 Torre L A, Bray F, Siegel R L, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, Jemal A . CA Cancer J Clin, 2015, 65: 87- 108. doi:10.3322/caac.21262

公司简介：沈阳莫德医药科技有限公司，由行业资深人士组成研发团队，专业研发制造近红外二区小动物活体荧光成像系统，有需求随时沟通，欢迎合作。

别名：NIR-II红外相机，NIR-II红外制冷相机，NIR-II红外低温相机，

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相机部分：

1、InGaAs 成像模块采用TEC电制冷方式，芯片工作温度达到-60℃或更低，且芯片工作温度可调；

2、InGaAs成像模块有效像素数量不少于640 x 512，每个像元尺寸不小于15微米；

3、InGaAs成像模块在900-1700nm具有高灵敏度，量子效率不低于70%；

4、对于微弱信号可实现不短于99秒的连续曝光；

5、能够实现近红外二区与彩色可见光的实时同步成像，且精确融合图像能够实时展示。

6、近红外二区成像具备过曝光预警功能。成像窗宽窗位可手动自由调节。且具备灰度图像自动增强功能。

7、可见光成像部分具备自动增益，自动曝光，自动白平衡功能，能够自动进行伽马矫正。融合算法先进，用户可以根据需求确定近红外与可见光融合的有效阈值。

8、红外图像、可见光图像和二者融合图像可以同时显示。拍照和录像数据可一键采集，且拍照和录像保存后可再次进行后续数据分析并不失融合。

9、成像参数与激光激发参数能够自动保存。

激光部分：

1、荧光激发光源采用两种波长激光光源（808nm, 980 nm），功率可调且总功率≥20瓦；

2、每种荧光激发光源各采用两根液芯匀光光纤，分布两侧，保证无死角照射。

3、每根光纤末端配备准直器，可调整荧光激发光的均匀照射。

4、可通过系统软件实现激光控制。

5、激光参数自动保存在成像参数中。

暗室及控制系统：

1、标配软件具备成像参数设置功能，如曝光时间、增益、相机工作温度、内外触发等，具备红外成像窗宽/窗位手动和自动调节功能；

2、可通过软件去除背景，实现成像的平场校正等功能；

3、能够实现100μs寿命材料的荧光寿命成像；

4、可同时装载至少5个发射光滤片，标配滤片数量不少于4个；

5、具备荧光寿命成像专用软件模块，可通过软件调节激发光照明时间、相机曝光时间和激发光与相机曝光间隔时间，具有延时成像能力；

6、寿命图像与材料单光子寿命分析结果误差在10μs以内；

7、具备5通道以上小动物气体麻醉功能；

8、能够实现小鼠全身成像和局部成像，视野范围可调，最大视野范围不小于10cm x 8cm；

9、动物载物台可电控升降，行程不小于50cm；

10、动物载物台具有加温保暖功能；

应用：

适合从事生物学、医学、天文学等科研工作者，特别适用于生物医学荧光成像、材料学荧光成像、荧光偏振成像、荧光寿命成像、天文成像和激光光斑分析等多种科研领域及军事、高端安防等应用领域。