近十几年，转录组学技术飞速发展，从研究层面分类的话，大体经历了三个主要的阶段。第一阶段研究主要是对大量混合细胞进行转录组学研究（bulk transcriptome），该方法能获得大量细胞的基因平均表达水平，虽然对推动细胞群体的特性认识具有重要作用，但无法获知群体内特定细胞的基因表达情况。 第二个阶段是对单细胞进行转录组测序（single cell transcriptome），该方法使对基因表达的研究深入到了单细胞层面，进而对细胞类型进行深入鉴定，揭示细胞异质性。 但基因表达具有时间特异性和空间特异性。时间特异性通常可以通过对不同时间点的样本取材，再使用单细胞转录组测序技术来进行解析，但由于单细胞研究获得细胞悬液时对组织进行了酶解，从而导致失去了组织空间位置信息。近年发展起来的高通量的空间转录组技术，如10x Genomics Visium空间组学技术、GeoMx DSP空间组学技术等，使对转录组的研究深入到第三阶段，利用该技术可以在组织原位同时获得基因表达特征和空间分布数据，进一步推进了对组织原位细胞真实基因表达的研究。此外，结合单细胞转录组和空间转录组进行联合研究，可使空间位置的基因表达研究结合到超高分辨率的单细胞层次，对于癌症、免疫、神经、发育等领域，有着令人期待的应用前景。
不同层面转录组研究
一、空间转录组学技术的优势
人体组织是由数万亿个细胞组成的高度复杂的系统，这些细胞在种类、时间和空间上各不相同，但相互协调，形成独特的微环境，以维持器官功能和处理信息，进而决定细胞的身份。 通过对人体器官分子基础研究的不断深入，人们逐渐达成了一种科学共识，即无数的具有不同功能类型的细胞，结合发育（时间）和区域（空间）差异，构成了哺乳动物器官转录异质性的主要因素。
生命科学中的许多重大发现都是从细胞与生物功能密切相关性中认识到的。在发育生物学中，诸如子细胞之间的对称破坏和细胞命运决定等中心主题都是基于细胞之间的空间关系。在临床环境中，组织病理学常被用作一种结论性的诊断工具，正是因为许多疾病的特征是组织中的空间特异性，感染和炎症过程可以彻底改变组织中的细胞结构。
现有的高通量单细胞测序技术的应用，使得在推断细胞类型和轨迹方面取得了巨大的成功，特别是将单细胞测序技术应用在发育相关研究中。利用伪时间分析、标记细胞起源的内源性条形码以及在一定时间间隔内连续取样的研究方法，初步揭示了细胞命运决定、细胞谱系和发育轨迹的问题。然而，空间异质性仍然是一个棘手的问题，单细胞测序研究中，细胞一旦在制备单细胞悬浮液中分离，就丢失了位置信息，这对于现有的基于微流控技术的高通量单细胞测序是很有必要的。通过结合成像和测序，最新的空间转录组学可以绘制出组织中特定转录本存在的位置，鉴定特定基因的表达位置，从而可以更加全面的从分子层次研究组织，使得向实现单细胞分辨率下获得基因表达位置信息的目标更加进了一步。
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大脑是哺乳动物中最重要而又最复杂的器官，也是一个很好的例子。由于大脑不同区域的组织具有不同的功能和细胞类型，空间异质性至关重要。早期研究揭示致病因素一般通过对主要生物标志物进行组织学染色。最近的研究利用DNA测序、基因芯片、转录组测序等技术手段，对来自大脑不同组织区域的数据进行高通量组学数据采集，如基因组学、转录组学和蛋白质组学等，用于更好的描述中枢神经系统结构的分子图谱。然而，特定细胞类型中重要基因的表达可能在混合细胞的检测中被掩盖，从而阻碍了进一步的研究。因此，这就需要对大脑分子图谱进行更加深入的绘制，该图谱需要具有更高的分辨率，并需要结合转录本的衍生位置信息，这样的大脑图谱将有望最终揭示这个复杂器官的空间异质性。
空间组学结合单细胞组学可加速神经科学研究
二、空间转录组学技术的发展
虽然空间转录组学技术的关键，在可检测基因的数量和可检测组织的大小方面存在很大差异，但本文重点讨论了能够跨组织区域进行转录组水平检测的技术。主要是空间转录组技术：1)基于NGS技术，在NGS测序前将位置信息编码到转录本上；2)基于成像的方法，包括原位测序（ISS）——转录本在组织中扩增和测序，和基于ISH的方法——成像探针在组织中被连续杂交。这些不同的技术可以被看作是汇聚在一个基因表达矩阵上，该矩阵捕获了每个点（即一个像素、一个细胞或一组细胞）的转录组。
1. 基于NGS技术的方法
2016年发表的空间转录组学（ST）技术可以得到空间分辨的全转录组信息。2018年底，ST技术被10x Genomics公司收购并进一步开发，命名为 "10x Visium"。10x Visium检测法在分辨率（直径55µm，条形码区域之间的距离更小）以及运行时间上都有改进。Slide-seq代替在玻片上打印区域条形码RT引物，它利用放置在载玻片上的随机条形码珠子来捕获mRNA。在Slide-seq方法发表后不久，另一种使用更小的条形码珠子的技术发布，命名为高分辨率空间转录组技术（HDST）。近期，开发了一种可在组织中使用确定性条形码进行空间组测序（DBiT-seq）的方法，该方法基于微流体的方法将条形码传递到组织玻片的表面，以实现10μm像素大小的分辨率。Stereo-seq使用随机条形码DNA纳米球沉积在阵列模式中，以实现纳米级分辨率。Seq-scope已经实现了亚细胞分辨率的空间条形码，可以用来可视化核和细胞质转录。Nanostring GeoMX DSP技术是将数据的捕获放在了一个个圆形的感兴趣区域（ROI）中，其将紫外线照射到ROI上，释放可光裂解的基因标签以进行测序定量。
在所有基于NGS的方法中，均为收集空间条形码RNA并进行测序。每个reads的条形码用于绘制空间位置，而测序reads的其余部分被映射到基因组，以识别转录源，共同生成一个基因表达矩阵。
2. 基于成像的方法
基于ISS的方法直接读出组织内转录本的序列。具体来说，RNA被逆转录，通过滚圈扩增，并进行测序。BaristaSeq是另一种基于缺口填充挂锁的方法，其读取长度增加到15个碱基。STARmap使用条形码挂锁探针，与靶标杂交，通过添加第二个引物，针对挂锁探针旁边的位点，避免了逆转录（RT）步骤。这种方法避免了cDNA转换的效率障碍，并通过增加第二个杂交步骤来降低噪音。到目前为止，所提到的方法都是基于对靶标的先验知识，FISSEQ是一种非靶标的方法，即捕获所有种类的RNA。尽管非靶向扩增会导致光学拥挤和灵敏度降低，但最近开发的扩张测序（ExSeq）已经证明其可以用于组织中的非靶向ISS 。
基于ISH的方法是基于成像的第二类方法，以ISH技术为基础，通过互补荧光探针杂交检测目标序列。smFISH利用多条短的寡核苷酸探针（大约20 bp）来靶向同一mRNA转录本的不同区域。虽然smFISH具有高灵敏度和亚细胞空间分辨率，但由于标准显微镜中光谱重叠的固有限制，它一次只能针对几个基因。seqFISH是一种多路smFISH方法，通过连续几轮杂交、成像和探针剥离，多次检测单个转录本。然而，杂交轮数的增加需要增加smFISH探针的数量，这使得seqFISH既昂贵又耗时。为了弥补seqFISH的大量耗时，2015年发布了MERFISH技术。这种技术可以鉴定单个细胞中数千种RNA的拷贝数和空间定位。它利用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量，并通过二进制条形码来抵消单分子标记和检测错误。
对于基于ISS和基于ISH的方法，是用图像处理生成基因表达矩阵。为了获得细胞级矩阵，要么手动分割小区域，要么系统地使用计算方法对图像进行分割。虽然这些可能并不符合真正的物理边界，但它们完成了将每个mRNA分配给细胞的任务。或者，数据分析可以从单个像素水平开始，并结合基因表达数据来描绘细胞。
空间转录组技术提供了一个基因表达矩阵
三、空间转录组学技术的应用
由于空间转录组技术提供了一个无偏的空间组成图像，已被用于生成组织图谱，作为参考提供了有价值的资源。
在神经生物学方面：基于空间转录组学的方法已经建立了整个小鼠大脑或特定区域的详细图谱，如视觉皮层、初级运动皮层、中颞回、下丘脑视前区、海马和小脑。相关研究在对背外侧前额叶皮质的分析中确定了已知精神分裂症和孤独症相关基因的空间模式，从而提出了精神分裂症遗传易感性的机制。
在发育生物学中：时间分辨的空间转录组图谱有助于阐明心脏发育、精子发生和肠道发育的空间动力学。同样，对人类子宫内膜在月经周期的增殖期和分泌期的全面研究发现了WNT和Notch信号在调节向纤毛或分泌型上皮细胞分化中的作用。这些图谱一直是合作项目协调努力的重点，为研究界提供有效资源，并得到Human Cell Atlas项目和Allen Institute for Brain Science的支持。
除了正常的发育和生理之外，空间转录组学很适合研究疾病中的组织结构紊乱。空间转录组学能够识别在癌症中起作用的机制，即正常生理功能的组织结构发生改变。随着人们对肿瘤微环境重要性的日益认识，空间转录组学已被用于研究其与不同状态癌细胞的关系。特别是，空间转录组学能够研究癌症和正常组织之间的分子特征。例如，在皮肤鳞状细胞癌中发现了免疫调节性癌细胞状态。空间转录组学还为神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症）、感染和炎症过程（如麻风病、流感和败血症）以及风湿病（包括类风湿性关节炎和脊柱关节炎）中组织失调机制提供了见解。
四、空间转录组学技术的未来
2018年单细胞转录组技术被Science 评为年度突破技术；2019年单细胞多组学被Nature Methods 杂志评为年度技术，预示着单细胞多组学研究将成为趋势，其中，单细胞结合空间转录组研究，使单细胞在三维空间领域的研究成为新热点。2020年空间转录组技术被Nature Methods 评为年度技术，进一步证实该技术具有巨大的发展空间，后续空间转录组技术将会在各个研究领域改变我们了解复杂组织的方式。
空间转录组学在发现疾病因子、建立空间图谱、描绘空间蓝图等方面已得到了广泛的应用和推广，但其潜力远不止于此。例如，在细胞间通讯的研究中，不同细胞类型的相互作用是从转录组学数据和已知的配体受体复合物中推断出来，然而，单个细胞之间正在进行的相互作用很难被立即捕捉到。无论是在组织中还是在培养环境中，空间相邻的细胞更有可能相互作用，这正是空间转录组发挥作用的地方，因此，将空间转录组学引入细胞间通讯研究是值得期待的。此外，单细胞组学技术在许多方面促进了空间转录组学的发展，例如可以从细胞分型提供标记基因，这反过来又可以利用空间位置信息协助单细胞组学区分亚群。此外，由于基于图像的空间研究方法可以提供亚细胞视图来观察单个细胞内的分子行为，这使得分析基因-基因相互作用组、基因调控网络和多模态组学成为可能。
李超 | 文案
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