植物在长期的进化过程中形成了复杂的调控网络，来参与植物生长发育和逆境响应，转录因子作为植物体内广泛存在的一类调节蛋白，能够与靶基因结构域结合，调节RNA的转录和表达，从而在这一过程中起着重要的作用。植物中目前已经被发现的转录因子家族众多，其中，WRKY是一类在开花植物中具有重要功能的转录因子，其广泛参与调节植物的防御反应和生长发育过程，所以该基因家族的研究一直是植物学界的热点之一。相信大家或多或少都有听说过这个基因家族吧，小远也是对它充满了兴趣，但由于WRKY现有的研究成果非常丰富，所以在这一期的推文中，只能先和大家一起来梳理一下WRKY在植物生长发育这一方面的研究进展，希望通过文章的阅读可以帮助大家更好的了解WRKY的“家庭背景”。
01背景介绍
1.1 WRKY转录因子的发现
1994年Ishiguro等人从甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出了第1个WRKY转录因子SPF1，并发现其受蔗糖诱导表达(Ishiguro et al., 1994)。至此有关WRKY的研究迅速拉开了帷幕，随着研究的不断深入，目前已经在拟南芥、水稻、大豆、杨树、黄瓜、玉米等多种植物中分离鉴定到了大量的WRKY转录因子，并且取得了非常多的研究成果。
1.2 WRKY转录因子的结构特点
该转录因子最主要的结构特点是各成员的DNA结合域中至少含有1-2个WRKY结构域。WRKY结构域是一段大约由60个高度保守的氨基酸残基所组成的多肽序列，其中WRKYGQK为所有成员中保守的7个氨基酸残基。另外，WRKY转录因子的DNA结合域中一般还含有一个锌指结构，由C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型锌指结构组成（图1）。WRKY转录因子可以通过WRKY结构域与靶基因启动子区的顺式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特异性结合，以此促进或抑制转录，进而调控下游基因的表达。
图1 WRKY结构域（黄幸等, 2019）。WRKYGQK基序为黄色，锌指结构的半胱氨酸/组氨酸为蓝色，4个β链用红色表示。I CT和I NT分别表示I组WRKY结构域的N端和C端。
1.3 WRKY转录因子的分类
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根据转录因子所含WRKY结构域的个数和锌指结构的特征，Eulgem等人将WRKY转录因子分为3大类：Group I含有2个WRKY保守结构域，其C端的锌指结构为C2H2型；Group II只含有1个WRKY保守结构域，锌指结构与I类相同，为C2H2型；Group III锌指结构为C2HC型，包含1个WRKY保守结构域（图1）(Eulgem et al., 2000)。为了反映WRKY结构域的演化过程，Zhang等人通过系统发育分析，将WRKY转录因子分为I、IIa+IIb、IIc、IId+IIe和III(Zhang et al., 2005)。Tamura等人通过纯系统发育数据分析进一步证实了Zhang等人的结果(Tamura et al., 2007)。通过对WRKY转录因子的进化分析对理解物生物多样性的整体机制，以及WRKY基因在植物调控网络中发挥的特殊功能具有重要的意义。
图2 高等植物WRKY基因家族系统发育树（黄幸等, 2019）。
02WRKY转录因子对植物生长发育的调控
有关WRKY转录因子的研究前期大部分集中在生物胁迫和非生物胁迫方面，而近年来，科学家们的研究结果表明WRKY转录因子在植物生长发育过程中同样具有不可或缺的功能。接下来，我们就具体来看看WRKY在生长发育方面都有哪些研究成果吧！
2.1 调控种子休眠、萌发
在开花植物中，种子从休眠到发芽的转变标志着生命周期的开始。为了增加环境适应性，植物会在适当的季节开始它们的生命周期。在此过程中，WRKY蛋白可以作为正调控或负调控因子，通过响应内外环境信号调控种子的休眠和萌发，进而影响植物生命周期的起始（图3）。
图3 WRKYs调控拟南芥、水稻和向日葵种子休眠和萌发的信号通路图(Wang et al., 2023)。
在拟南芥中，通过对种子休眠的主要调节因子FUS3和ABI3的研究表明，I型AtWRKY转录因子可能与AtFUS3启动子结合并正向调节该基因的表达，从而抑制种子休眠被打破的过程（图3）(Roscoe et al., 2019)。对AtWRKY41的研究进一步阐明了WRKY调控种子休眠的信号通路，结果表明AtWRKY41的沉默会导致种子休眠期缩短，并且导致成熟和吸水种子中AtABI3转录的下调。此外，AtWRKY4可以直接结合AtABI3启动子中的W-box元件从而正向调节其表达（图3）(Ding et al., 2014)。而在水稻中，OsWRKY29的缺失突变则增强了种子休眠。并且，在没有ABA的情况下，OsWRKY29可以与水稻ABA反应基因OsVP1以及脱落酸反应元件结合因子OsABF1的启动子结合以下调它们的表达从而缩短种子的休眠期（图3、图4）(Zhou et al., 2020)。
图4 OsWRKY29调节种子休眠的模式图(Zhou et al., 2020)。
种子休眠被打破之后，WRKY转录因子会通过调节转录、蛋白合成、ABA信号转导的抑制等来控制种子的萌发。例如，AtWRKY2、AtWRKY40和AtWRKY63通过下调ABA响应基因AtABI3、AtABI4、AtABI5、AtEM1和AtEM6的表达来减少ABA信号以促进种子萌发和萌发后生长（图3）(Jiang et al., 2009; Chen et al., 2010; Ren et al., 2010)；而AtWRKY6、AtWRKY18、AtWRKY43和AtWRKY60，则通过激活ABA响应基因表达来抑制种子萌发（图3、图5）(Chen et al., 2010; Huang et al., 2016; Geilen et al., 2017)。此外，水稻OsWRKY50可以通过直接抑制ABA生物合成基因OsNCED5的表达来促进种子的萌发和幼苗的生长（图3）(Huang et al., 2021)。
图5 WRKY18、WRKY40和WRKY60参与ABA反应的模式图(Chen et al., 2010)。
2.2 调控幼苗的形态发生
当植物的幼苗突破土层后，它们将经历一个营养生长阶段，使植物可以积累足够的养分。在这个过程中，WRKY转录因子被证明参与调控下胚轴、根、茎和叶等多种组织和器官的发育。
2.2.1 WRKY对植物下胚轴伸长的调控
WRKY在植物幼苗阶段的光形态建成中起着重要的作用（图6）。例如，AtWRKY36通过与AtHY5启动子区域的直接结合来下调其在白光下的转录，从而促进幼苗下胚轴的伸长；而UVB激活的AtUVR8可以通过与AtWRKY36的相互作用，来抑制AtWRKY36与AtHY5启动子区域的结合，从而防止转录因子对AtHY5转录的抑制（Yang et al., 2018）。与AtWRKY36不同的是AtWRKY32的功能丧失会导致下胚轴的伸长，这表明该转录因子触发了光形态发生。而在黑暗条件下AtCOP1会抑制AtWRKY32从而导致下胚轴的伸长(Zhou et al., 2022)。
图6 拟南芥WRKYs在红光或蓝光（左）、UVB光（中）和黑暗（右）条件下调节下胚轴伸长的信号通路图(Wang et al., 2023)。
2.2.2 WRKY对根系生长的调控
植物激素是根系发育的关键调节剂。生长素在促进侧根萌生和伸长方面起着重要的作用，而乙烯则主要是通过调节生长素途径来抑制根的伸长。在拟南芥中，AtWRKY23的表达在受到生长素以及生长素响应因子AtARF7和AtARF19调控的同时，可以通过刺激黄酮醇的局部生物合成来影响根系的发育(Grunewald et al., 2012)。此外，还有研究表明AtWRKY23可以通过调节生长素的分布模式来调控根系的生长(Prát et al., 2018)。在水稻中，OsWRKY31可能通过激活生长素信号转导的负调节因子OsIAA4和OsCrl1的表达来限制侧根的形成和伸长(Zhang et al., 2008)。在小麦中，TaWRKY51可以直接结合乙烯生物合成基因TaACS的启动子来抑制其转录从而下调乙烯的生物合成，进而促进生长素信号通路和侧根形成（图7）(Hu et al., 2018)。
除植物激素之外，根系的发育也受活性氧（ROS）的影响。例如，杨树PdeWRKY75和水稻OsWRKY62/76可以通过促进ROS的积累来调控根系分生组织活性和根系发育(Xu et al., 2017; Zhang et al., 2022)。而拟南芥的AtWRKY53/70则可以通过抑制ROS的产生来负调控根系的伸长（图7）(Li et al., 2020)
此外，WRKY转录因子还参与调节根毛的形态，在拟南芥中AtWRKY75可以通过直接结合AtCPC的启动子来抑制其表达，从而抑制根毛的发育（图7）(Rishmawi et al., 2014)。
图7 WRKY在植物营养阶段调节其发育过程的信号通路图(Wang et al., 2023)。
2.2.4 WRKY对植物株型的调控
在植物的生长过程中，WRKY还参与调节了植物的分枝以及株高，从而影响植物最终的株型。在调控分枝方面，WRKY71/EXB1可以通过正调控RAX1的转录来控制腋芽分生组织（AM）的启动，从而增加植株的分枝数，并且WRKY71/EXB1还可以通过调节生长素途径来影响AM的启动以及新芽的生长（图7、图8）(Guo et al., 2015)。在调控株高方面，OsWRKY36可以通过增加SLR1的转录来影响GA（赤霉素）信号的传导，从而使植株矮化（图7、图9）(Lan et al., 2020)。此外，部分WRKY转录因子还可以通过减少BR（油菜素内酯）的产生或者抑制一系列参与细胞伸长的基因的表达来介导植物的矮化。
图8 WRKY71/EXB1调控植物分枝的模式图(Guo et al., 2015)。注：EXB1编码WRKY转录因子WRKY71，该因子具有反式激活活性。
图9 OsWRKY36通过稳定SLR1表达来抑制植物株高和籽粒大小(Lan et al., 2020)。
2.3 调控植物的开花时间
植物在营养发育阶段积累了足够的能量和养分之后，就会进入生殖阶段，在这一阶段植物可以通过响应内源和外源信号对开花时间进行精准调控。近年来的研究表明，WRKY家族成员在植物的开花过程中起着重要的作用（图10）。例如，在拟南芥的春化途径中，冷诱导的AtWRKY34可以与AtCUL3A启动子结合激活其表达，E3泛素连接酶AtCUL3A进而促进AtFRI的降解，导致染色质中AtFLC基因的H3K4me3水平降低，从而对AtFLC表达产生抑制作用，最终诱导开花基因的表达促进开花。在另一项研究中，作者发现WRKY63在非春化条件下可以通过激活AtFLC来抑制开花，但是在春化条件下则可以通过激活AtFLC的阻遏物COOLAIR和COLDAIR来促进开花(Hung et al., 2022)。在GA（赤霉素）介导的开花途径中，DELLA蛋白可以与AtWRKY12及其同系物AtWRKY13互作，从而改变其对下游基因AtFUL的转录调控来影响开花。除了参与GA通路之外，AtWRKY12和AtWRKY13还在年龄途径介导的开花中通过调节miR172b的表达来影响开花(Zhang et al., 2018)。在光周期途径中，OsWRKY11和MlWRKY12被发现可以通过调节AtFT的转录来影响植物的开花时间。
除了上述的信号途径之外，在某些胁迫条件下，植物通常会表现出延迟开花的表型来逃避持续的胁迫，或者加速开花以确保繁殖成功。而作为众所周知的胁迫反应因子，WRKY可以有效地帮助植物逃避胁迫，例如，RtWRKY23在拟南芥中过表达可以增强植株对盐胁迫的耐受性并延迟开花。而在严重胁迫条件下AtWRKY8、AtWRKY28以及AtWRKY71则可以通过激活AtFT和AtLFY的表达来介导盐响应开花，使植物能够快速完成其生命周期(Yu et al., 2018; Yu et al., 2016)。除此外，GsWRKY20、GmWRKY58、GmWRKY76、OsWRKY72以及CpWRKY71的异源表达可以导致拟南芥提早开花，而CsWRKY7则具有延迟开花的作用。
图10 WRKY转录因子在植物开花时间调控中的示意图(Wang et al., 2023)。
2.4 调节配子发育
在早期配子发生阶段，AtMPK3和AtMPK6对AtWRKY2和AtWRKY34的磷酸化导致AtGPT1的表达上调，这对花粉的适应性和成功繁殖非常重要。AtWRKY2/34还可以与VQ基序（FxxhVQxhTG）的蛋白质VQ20协同作用来调控花粉的发育。此外，在拟南芥中的研究表明BR（油菜素内酯）信号通过短暂激活WRKY23转录因子，限制胚珠原基远珠心区的多个亚表皮细胞获得大孢子母细胞（MMC）命运（图11）(Cai et al., 2022)。
图11 WRKY参与调控大孢子母细胞形成的模式图(Cai et al., 2022)。
2.5 调节种子的发育及大小
在植物胚胎发育过程中，磷酸化的AtWRKY2可以直接激活AtWOX8的表达，来调节合子的延伸及不对称性。此外，生长素响应基因AtWRKY23的抑制表达会影响顶基轴和根干细胞生态位，从而导致胚胎发育的异常(Grunewald et al., 2013)。
在调控种子生长方面，AtWRKY10可能与AtSHB1和AtIKU1形成复合物来促进AtIKU2的表达从而影响种子的生长。而除了作为AtIKU通路的核心调节因子外，AtWRKY10还可以通过其他信号通路控制种子发育。例如，AtAN3与AtWRKY10启动子结合并调节其表达，进而影响种子胚胎的发育。AtWRKY10通过直接结合细胞分裂素氧化酶基因AtCKX2的启动子来影响细胞分裂介导的种子发育。AtWRKY44对于种子发育同样很重要，与野生型相比该基因的突变会导致种子变小并且种子颜色较浅，种子生长受限以及异常的种皮着色分别是种皮细胞伸长受抑制以及种皮中单宁和粘液生成减少造成的(Garcia et al., 2005; Gonzalez et al., 2016)。此外，在水稻中，OsWRKY53的功能缺失突变会导致谷粒变小，而OsWRKY53的过表达会增加谷粒的大小。通过进一步的分析发现，OsWRKY53与OsMPK6相互作用并被OsMKK4-OsMPK6级联磷酸化，磷酸化的OsWRKY53能够调节油菜素内酯（BR）反应，表明OsWRKY53在调控水稻籽粒大小的过程中可能位于BR信号通路和MPK级联的关键节点(Tian et al., 2017)。
图12 WRKY转录因子在胚胎发生和种子发育调控中的工作模型(Wang et al., 2023)。
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文章至此就告一段落了，因为有关WRKY转录因子的研究实在是太多了，所以在本次的推文中，小远主要是和大家一起学习WRKY在植物生长发育这一方面的研究成果，希望大通过阅读本文可以对WRKY家族有进一步的了解。另外，本次的推文中只总结了一部分研究进展，大家如果想了解更多的内容，推荐大家阅读“Functions of WRKYs in plant growth and development”这篇文章，希望大家会有更多的收获哦！
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