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今天跟大家分享一篇生信+实验进行TGF-β机制研究的高分好文，文章标题：TGF-β promotes microtube formation in glioblastoma through thrombospondin 1.
研究背景
微管(MTs)是胶质瘤细胞的胞质延伸，是一种重要的细胞通讯结构，通过网络形成促进肿瘤侵袭和治疗耐药。MT在化疗耐药的胶质瘤中大量存在，尤其是胶质母细胞瘤（GBMs），而在化疗敏感的IDH突变和1p/19q共同缺失的少突胶质细胞瘤中很少见。本研究的目的是确定参与MT形成的潜在信号通路。
研究思路首选基于TCGA数据进行生信分析，以探究GBMs和少突胶质瘤之间的差异。然后用患者衍生的GBM干细胞系来研究MT在体外和体内异位移植模型的TGF-β刺激和抑制下的形成。最后进行RNA测序检测用TGF-β刺激的GBM细胞系之间的共性和差异。
研究结果
1、基于TCGA数据探究GBMs和少突胶质瘤之间的差异
作者首先比较了TCGA数据库中IDH-wt肿瘤(主要是GBMs)与IDH突变和1p/19q共同缺失的少突胶质细胞瘤的基因表达特征。发现与少突胶质细胞瘤相比，GBMs中TGFB1和TGFB2表达高度上调。对组间差异基因功能富集分析发现与细胞外基质和肿瘤侵袭相关通路显著富集。由于MT的形成也高度依赖于细胞外基质的重组，这可能表明TGF-β在这一过程中发挥着重要作用。作者从文献中收集了TGF-β相关基因，发现这些基因中大多数在GBMs组中上调。进一步通过连接图分析与基因表达特征相关的药物，发现TGF-β抑制剂是抑制IDH-wt GBM特征的首要候选药物之一。
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2、探究TGF-β在GBM细胞系MT的形成中的作用
首选用不同的生长因子（EGF、FGF、PDGFbb、TGF-β1或TGF-β2）刺激P3 GBM细胞，比较其诱导细胞质突起（MT-like结构）的能力，发现TGF-β1对促进细胞突起的效率最高。然后电子显微镜验证细胞在TGF-β1刺激下通过MTs相互连接。还用GAP43/巢蛋白或肌动蛋白染色的共聚焦显微镜详细分析和量化了MTs的形成。最后还使用TGF-β抑制剂处理P3 GBM细胞发现MT的形成受到明显抑制。总之，TGF-β1刺激促进了MTs的形成，且增加了通过MTs连接的细胞数量。
3、TGF-β诱导的MT形成与侵袭有关
在本工作中使用的GBM细胞系中，我们发现一个GSC系，即GG6，在TGF-β1刺激下没有显示MT形成的增加。GG16，作为一个对照细胞系，证实在刺激下有明显的MT形成（图3a）。由于MT的形成与侵袭有关，作者比较了TGF-β1刺激下无MT形成的细胞系GG6与有MT形成的GBM细胞系GG16这两种细胞系的侵袭性，发现对TGF-β1刺激有反应的细胞系GG16显示出对类器官的大量侵袭，且在用抑制剂抑制TGF-β后侵袭明显减少，表明类器官微环境中有TGF-β的内源性存在。最后将两种细胞系植入体内后，进一步验证了与有反应GG16相比，无反应者GG6的侵袭表型较小，且MT密度降低。
4、SMAD的激活对MT的形成很重要
为了确定TGF-β1诱导的MT形成的主要信号媒介，作者通过与nestin的双重免疫荧光染色，分析了P3、GG6和GG16细胞系在TGF-β1刺激下下游途径的激活情况。结果发现，在P3和GG16中，典型的（SMAD2/3）信号与MT的形成相关，然而，在GG6中，pSMAD2/3激活水平较低。在TGF-β1刺激下，使用SMAD抑制剂SIS3对SMAD进行抑制，明显减少了MT的形成。作者用pSMAD3和nestin抗体对7个GBM IDH-wt病人活检的连续切片进行免疫染色进一步证实了SMAD2/3磷酸化在MT形成中的作用。
5、挖掘参与MT形成过程中TGF-β1和SMAD2/3下游的基因
为了确定参与TGF-β1和SMAD激活下游MT形成的可靶向蛋白，作者对有反应的细胞系GG16和P3以及无反应的细胞系GG6进行了RNA测序，在有无TGF-β1刺激的情况下，确定基因表达谱的差异。发现在TGF-β1刺激下明显上调的基因数量在细胞系之间有很大的不同。基因富集分析显示，在所有3个细胞系中，细胞外结构组织和细胞外基质组织是受调控最多的GOs。然后作者从这些GOs中的基因中筛选到TSP1基因作为候选基因，因为TSP1是GBM中TGF-β1和SMAD3信号传导的下游媒介，在肿瘤细胞侵袭中很重要。而且对TCGA数据的分析也证实，与IDH突变和1p/19q共同删除的少突胶质瘤相比，TSP1在IDH-wt GBM中的上调。
6、TSP1被TGF-β1激活并介导MT的形成
在此，作者实验发现TSP1蛋白的表达在TGF-β1刺激下在反应者细胞系GG16和P3中被诱导，而在无反应者细胞系GG6中则没有。此外，shRNA敲除TSP1的表达，发现ShTsp1明显减少了P3细胞的MT形成。总之，实验结果证实了TSP1的表达，是通过pSMAD3激活TSP1启动子而被TGF-β信号上调的。最后活体成像进一步验证了TGF-β和TSP1是体内MT形成的重要参与者。
研究结论
TGF-β是通过SMAD和Tsp1信号传导参与MT形成。阻断这一途径可能有助于打破MT驱动的复杂的侵袭/耐药机制，是未来治疗GBM的一个有力策略。
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