作者：生物谷
2023年1月20日，美国普渡大学陶纬国教授团队在国际期刊cells杂志上发表了一篇题为“Proteomics, Phosphoproteomics and Mirna Analysis of Circulating Extracellular Vesicles through Automated and High-Throughput Isolation”的研究文章，该研究创造性地提出了一种基于磁珠的高通量外泌体自动分离技术平台，并成功应用于EVs表征、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和miRNA分析。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是一种由细胞释放到细胞外基质的30~1000nm膜性小囊泡，参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程。近年来，EVs的预后和诊断价值已经在多种类型的癌症中受到广泛关注，EVs的广泛应用可以促进其作为临床癌症诊断生物标志物和治疗靶标的使用，有望提供未来新型的肿瘤治疗策略。
目前几种常用的分离EVs的技术包括：超速离心、密度梯度离心、免疫亲和作用、沉淀聚集、超滤、尺寸排阻等。现有方法的固有局限性，如纯度低、产率低、囊泡完整性差、处理时间长、成本高、回收效率低等，限制了快速、高效、方便地捕获EVs和下游分析其潜在应用。
该研究介绍了一种基于磁珠的EV富集方法(EVrich)，用于尿液样本的自动化和高通量处理。可在96孔板中进行平行富集，用于下游货物分析，包括EV表征、miRNA、蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析。
文章要点：
一、外泌体自动分离提取设备及其下游分析
先前的研究表明，EVtrap磁珠可以高产率和高纯度地从不同的生物体液中高效地提取EVs，并能够有效地鉴定大量EVs衍生的磷酸化多肽。研究者将EVtrap磁珠改装成96孔板式的自动化EVs分离提取设备，命名为“EVrich”，并优化了一系列运行参数，以获得最佳分离效果。如图1A所示，该设备包括混合、孵育、清洗和洗脱四个步骤。
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图1A 外泌体自动分离提取设备工作流程
随后，研究者利用“EVrich”分离的EVs，开展了EVs表征、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和miRNA分析，证实了外泌体自动分离提取设备“EVrich”的临床应用价值。流程图如图1B所示。
图1B 外泌体表征、蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学和miRNA分析
二、外泌体自动分离提取设备分离的外泌体性能鉴定
为了评估“EVrich”相对于已有的外泌体提取技术的性能，研究者对比了其与超速离心以及基于EVtrap磁珠的外泌体手动提取技术的优劣。透射电镜显示“EVrich”可保留EVs典型的均匀球形结构（图2A，B），RPS（电阻脉冲传感）技术表明“EVrich”可分离更小尺寸的EVs（图2C），WB（蛋白质免疫印迹）实验证实了“EVrich”可稳定分离提取纯度高的外泌体（图2D），EVs标记物TSG101、CD9、CD81、HSP70显著表达，且各组重复性优于其余两组。
图2 “EVrich”分离提取的EVs性能鉴定
为了进一步证明“EVrich”在临床样本（如尿液）中的应用，研究者连续两日，每日两次收集三位健康者的尿液标本，以确证样本在“EVrich”的不同位置（随机选择）或在不同日期处理时，EVs产量和纯度的稳定性（图3A）。WB结果显示不同标本具有高度的一致性和稳定性（图3B，C）。
图3 “EVrich”分离提取设备的稳定性评估
LC-MS/MS（液相色谱-质谱/质谱）结果表明“EVrich”自动分离提取的EVs样本具有与基于EVtrap磁珠的外泌体手动提取技术相当的纯度（图4A），且两者识别的EVs总肽、总蛋白和miRNA无明显差异（图4B-D）。
图4 “EVrich”分离提取设备的EVs灵敏性分析
三、“EVrich”在前列腺癌蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学生物标志物发现中的应用
7对（前列腺癌VS前列腺炎/前列腺增生症）尿液标本用于测试“EVrich”是否可转化为临床应用。共鉴定出47563个蛋白肽（对应4328个蛋白质）和8961个磷酸化肽（对应1606个磷酸化蛋白质），火山图和热图展示了组间差异（图5A-D）。箱式图详细展示了三种蛋白质和一种磷酸化蛋白质可作为前列腺癌潜在的生物标志物（图5E-H）。
图5 “EVrich”在前列腺癌蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学生物标志物发现中的应用
四、前列腺癌尿样EVs中miRNA的分析
miR-145在前列腺癌患者尿液样本中高表达，可作为前列腺癌潜在的诊断生物标志物（图6）。
图6 miR-145在前列腺癌患者尿液样本中高表达
综上所述，该研究通过在EVrich系统上使用EVtrap提取的EVs的尺寸分布、产率和纯度，证明了该系统可以应用于分析大量临床样本，并能够在临床环境中分离EVs。结合前列腺癌和其他非癌性前列腺疾病患者的尿液EVs的无标签蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学，该研究鉴定出268个显著过表达的蛋白质和186个显著过表达的磷酸化肽，对应于48个磷酸化蛋白。其中，多种蛋白质和磷酸化蛋白此前与前列腺癌或其他癌症类型相关，表明初步筛查的成功，尿液EVs有望成为未来探索的特异性生物标志物来源。
此外，该研究还通过测量miR-125b和miR145，证明了通过EVrich系统从EVs中分离出miRNA，它们的比值能够对前列腺癌进行统计学鉴别。综上所述，EVrich可以在较短的时间内从数十个样品中高效提取EVs，最大限度地减少人工操作带来的技术变异性。这使得它适用于大规模的基于EVs的临床疾病检测，并为液体活检中的EVs研发和转化发现开辟了新的途径。总之，EVrich代表了一个通用的、可扩展的、简单的EVs分离平台，可以为广泛的研究和临床应用提供下游EVs货物分析。
参考文献
Zhang, H., Cai, Y. H., Ding, Y., Zhang, G., Liu, Y., Sun, J., Yang, Y., Zhan, Z., Iliuk, A., Gu, Z., Gu, Y., & Tao, W. A. (2022). Proteomics, Phosphoproteomics and Mirna Analysis of Circulating Extracellular Vesicles through Automated and High-Throughput Isolation. Cells, 11(13), 2070.
Wu X, Li L, Iliuk A, Tao WA. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 2018 Sep 7;17(9):3308-3316. doi: 10.1021/acs.jproteome.8b00459. Epub 2018 Aug 17. PMID: 30080416; PMCID: PMC7236337.
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