作者：肝胆相照平台
HBV相关慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF），指在慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化基础上，各种诱因引起的，以急性黄疸加深、凝血功能障碍为临床表现的综合征，可出现肝性脑病、腹水、电解质紊乱、感染、肝肾综合征、肝肺综合征等并发症，以及肝外器官功能衰竭。HBV-ACLF短期病死率高，目前除肝移植外，尚无有效的治疗方法，因此早期预测患者预后非常重要。
在国家传染病医学中心第一届感染合作论坛暨首届东方国际感染病学术周上，解放军总医院第五医学中心王福生院士/徐若男教授团队分享了乙型肝炎病毒（HBV）相关急性肝衰竭患者NK细胞减少与不良预后的临床研究新进展。肝胆相照平台特将精华整理成文，以飨读者。
1、研究背景
APASL对ACLF的定义为慢性肝病基础上突发急性肝功能恶化，表现为黄疸（TBil≥5 mg/dL）、凝血功能障碍（INR≥1.5或PTA＜40%）、发病4周内合并腹水和/或肝性脑病（HE），同时伴有28天的高病死率（>40%）[1]。中国是乙肝大国，慢性HBV感染患者约8600万，活动性乙型肝炎患者约2800万。HBV-ACLF占所有ACLF患者的62.5%[2]。慢性肝病基础上肝内外急性损伤会诱导ACLF的发生。
ACLF的治疗主要包括内科综合治疗（抗病毒治疗、对症治疗、营养支持、人工肝支持），其28天死亡率＞40%；肝移植治疗，但其一年死亡率约13%-17%，且肝源少、费用高；以及特殊治疗，包括激素、血浆置换、粪菌移植等，但疗效尚不确定。总体来讲，仍缺乏有效的治疗手段[3]。
ACLF的临床免疫学特征是炎症与免疫抑制共存。天然免疫在早期即可诱导持续性炎症、抑制免疫应答，造成患者死亡。其中，自然杀伤（NK）细胞是天然免疫中重要的免疫效应细胞。本研究主要针对NK细胞开展研究。
NK细胞的主要功能是杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞。其功能受到多因素调控[4]。图1所示为外周血和肝脏NK细胞分群标志物信息[5]。其标志物的变化可以反映NK细胞功能的变化趋势。
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图1. 外周血和肝脏NK细胞标志物
现有针对ACLF中NK细胞变化特点的研究发现：
1）外周血NK细胞数量减少，表型和功能异常[6]；
2）在小鼠中的研究发现，Fas/FasL途径介导NK细胞诱导的肝细胞凋亡[7]；
3）KCTD9是NK细胞诱导肝损伤的效应分子[8]。
2、研究结果
1. 研究对象及入排标准
CHB：根据《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》制定入组标准：1）HBV感染6个月以上；2）HBsAg阳性，HBeAg阳性以及HBV DNA>2x104IU/ml或HBeAg阴性、HBV DNA>2x103IU/ml；3）持续或反复的ALT升高或肝组织有明显炎症及坏死和/或纤维化（G2/S2）。
ACLF：根据《Acute-on-chronic liver failure: consensus recommendations ofthe Asian Pacific association for the study of the liver (APASL)》制定入组标准：1)曾诊断或未诊断的慢性肝病或肝硬化患者基础上，突发急性肝功能恶化；2）黄疸（血清胆红素≥5 mg/dL[85.5 μmol/L]）；3）凝血障碍（INR≥1.5或凝血酶原活性<40%）；4）4周内出现腹水和/或肝性脑病。
排除标准：1）合并HCV和HIV等病毒感染、自身免疫性疾病和恶性肿瘤的患者；2）患者基本资料信息不完整；3）患者血样采集困难且依从性差。
2. HBV-ACLF患者抗病毒治疗及打击诱因分析
在慢性乙型肝炎的肝病基础之上的二次打击，包括病毒突破/反弹、细菌或真菌感染、酒精摄入、其他原因（疲劳/出血）等（表1）。
表1. HBV-ACLF患者抗病毒治疗及诱发因素分析
3. HBV-ACLF患者基线外周血NK细胞数量降低
我们对患者外周血中NK细胞的计数和百分比进行了分析，发现与健康对照组和CHB组相比，HBV-ACLF患者的总NK细胞计数和CD56dimNK细胞计数明显降低。此外，与健康对照组相比，HBV-ACLF患者的CD56dimNK细胞百分比也降低（图2）。
图2. 入组患者基线外周血NK细胞数量
4. 基线外周血NK细胞数量与患者疾病严重程度、MELD评分、HBV DNA的水平密切相关
根据HBV-ACLF患者疾病结局将其分为幸存者组和非幸存者组，非幸存者患者的总NK细胞和CD56dim NK细胞数量显著降低。总NK细胞计数和CD56dim NK细胞计数与MELD-Na评分呈负相关。在HBV-ACLF患者中，CD56dimNK亚群与血清HBV DNA水平呈负相关，CXCR3+ CD56dimNK与HBV DNA水平呈正相关（图3）。
图3. 基线外周血NK细胞数量与患者疾病严重程度、MELD评分、HBV DNA的关系
5. 外周血NK细胞数量减少可以预测疾病预后
ACLF启动复杂的免疫反应，发生过度的全身炎症，同时会继发免疫抑制，这种免疫反应与患者不良预后密切相关。mHLA-DR的低表达被认为与免疫抑制和ACLF的高死亡率相关。在本研究中，我们观察到ACLF患者中mHLA-DR的表达显著下降。mHLA-DR水平与总NK细胞计数呈正相关。mHLA-DR对预测ACLF患者的预后具有较好的敏感性和特异性。同时，总NK细胞计数比mHLA-DR有更好的预测价值（图4）。综上所述，外周血NK细胞数量减少可以预测不良预后。
图4. 外周血NK细胞数量减少可以预测不良预后
6. HBV-ACLF患者基线外周血NK细胞凋亡/迁移增加
NK细胞主要分为CD56dim和CD56brightNK细胞两大类。我们分析了不同组患者中不同亚群的表型和功能特征。结果显示，与CHB和对照组患者相比，HBV-ACLF患者caspase-3+（凋亡）、CXCR3+（迁移）和ki67+（增殖）NK细胞的表达更高（图5）。
图5. 入组患者基线外周血NK细胞数量与表型功能差异
7. HBV-ACLF死亡组患者基线NK细胞凋亡/迁移增加且与MELD-Na评分密切相关
在HBV-ACLF死亡组患者caspase-3和CXCR3+NK细胞水平高于存活组。且caspase-3+ NK细胞比例与MELD-Na评分呈正相关（图6）。
图6. HBV-ACLF患者NK细胞功能及其与MELD-Na评分的关系
8. HBV-ACLF患者基线血浆细胞因子CXCL-10、IL-6、IL-8、IL-15表达升高
为了探讨NK细胞减少的原因，本研究检测了外周血中细胞因子包括CXCL-10、G-CSF、GM-CSF、granzyme B、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15和TNF-α的变化。与健康对照组和CHB组相比，HBV-ACLF组的CXCL-10、IL-6和IL-15水平显著升高。此外，HBV-ACLF组中CXCL-10表达的增加与总cas-3+、cas-3+CD56bright、cas-3+CD56dimNK细胞的水平呈正相关（图7）。说明CXCL-10、IL-6、IL-8可能与NK细胞凋亡相关。
图7. HBV-ACLF患者基线血浆细胞因子的表达水平
9. CXCL-10促进NK细胞凋亡
通过体外研究，我们将纯化的NK细胞与HBV-ACLF患者的血浆共培养，观察到NK细胞中膜联蛋白V的表达上调。用IL-6、IL-8和CXCL-10体外处理纯化的NK细胞6h，以研究这些细胞因子对NK细胞凋亡的潜在影响。结果显示，CXCL-10处理导致NK细胞中膜联蛋白V的表达显著增加。此外，将纯化对照人群的NK细胞与来自HBV ACLF患者的血浆共培养时，添加抗IL-6、抗IL-8和抗CXCL-10单克隆抗体可阻断NK细胞凋亡的增加（图8）。
图8. CXCL-10促进NK细胞凋亡
10. HBV-ACLF患者肝内NK细胞数量和CXCL-10表达升高
我们发现HBV-ACLF患者相较于CHB患者肝脏NK细胞数量和CXCL-10表达明显升高（图9）。
图9.HBV-ACLF患者肝内CXCL-10表达
11. HBV-ACLF患者基线外周血NK细胞活化水平增加，且与MELD-Na评分相关
HBV-ACLF患者活化受体NKp46和NKG2D的表达水平显著高于CHB患者。PD-L1、NKG2A、CD96、NKp44和CD69分子的表达在存活者和非存活者之间没有差异。NKG2D+ NK细胞百分比与MELD-Na评分呈正相关，而抑制性受体TIGIT+ NK细胞百分比与MELD-Na评分呈负相关。RNA测序结果显示，HBV-ACLF组的NK细胞中免疫应答通路被激活（图10）。
图10. 入组患者基线外周血NK细胞活化水平及其与MELD-Na评分的关系
12. HBV-ACLF患者基线外周血NK细胞杀伤及炎症因子分泌能力增强
我们检测了不同人群中与NK细胞杀伤能力相关的炎症细胞因子和受体。如图11所示，HBV-ACLF患者NK细胞CD107a、GM-CSF和IFN-γ的表达均较高。
图11. 入组患者基线外周血NK细胞杀伤及炎症因子水平
13. HBV-ACLF不同生存结局患者间基线NK细胞杀伤及炎症因子分泌及其与MELD-Na评分的关系
在HBV-ACLF组中，死亡组NK细胞中FasL、TRAIL、CD107a、GM-CSF和IFN-γ的表达量高于存活组。除FasL、TRAIL和IFN-γ外，这些标记均与MELD-Na评分呈正相关（图12）。
图12. HBV-ACLF不同生存结局患者间基线NK细胞杀伤、炎症因子分泌及其与MELD-Na评分的关系
3、研究结论
1. HBV-ACLF患者外周血NK细胞数量减少且对28天死亡率具有良好的预测价值。
2. 炎症因子CXCL-10升高诱导的NK细胞凋亡增加，肝内CXCL-10分子诱导的NK细胞向肝内迁移可能是造成外周血NK细胞数量减少的重要原因。
3. HBV-ACLF患者的NK细胞活化，杀伤及炎症因子分泌能力上调。
专家简介
王福生 院士
中国科学院院士，主任医师。
解放军总医院第五医学中心感染病医学部主任，国家感染性疾病临床医学研究中心主任。
国家新型冠状病毒联防联控工作机制科研攻关专家组专家。
国务院学位委员会第八届学科评议组专家、国家及军队生物安全专家组专家，全国创新争先奖状获得者，全国优秀科技工作者，全国抗击新冠肺炎疫情先进个人，全国优秀共产党员，全军科技领军人才，国家杰出青年基金获得者，国家自然科学基金创新研究群体牵头人，中华医学会感染病学分会候任主任委员。
长期从事感染病的临床诊治、科学研究及生物安全工作，圆满完成2003年抗击SARS、2009年甲流防治、2015年援塞抗埃、2020年新冠肺炎等多起重大疫情临床救治。擅长病毒性肝炎、艾滋病和疑难危重肝病的临床诊治工作，并结合临床难题开展研究，开拓了疑难肝病和艾滋病等疾病细胞治疗与研究的新方向。
专家简介
徐若男 医学博士
解放军总医院第五医学中心感染病医学部 副研究员 硕士研究生导师。
长期致力于天然免疫在炎症性疾病和感染性疾病中的作用机制研究，并围绕艾滋病和重症肝病开展了多项国际注册的干细胞、免疫细胞治疗研究。现任亚太医学生物免疫学会常务理事兼副秘书长，中国免疫学会临床免疫分会委员，全军传染病学专业委员会生物治疗学组委员。国家自然科学基金创新群体重要成员，卓越期刊Infectious Diseases &Immunity青年编委，国家自然科学基金评审专家，享受军队优秀专业技术人才岗位津贴。以第一作者或通讯作者身份在《Signal Transduction and Targeted Therapy》、《Cell Mol Immunol》、《EBioMedicine》、《Stem Cell Res Ther》等杂志上发表研究论文数十篇。以负责人身份承担国家重点研发计划、国家自然科学基金面上项目、全军十三五重大专项课题、北京市自然科学基金等省部级课题多项，申请技术发明专利4项，参编书籍3部。
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王贵强，王福生，庄辉，等. 慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)[J]. 中国病毒病杂志, 2020, 10(01): 1-25.
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本文图片源自发表论文，整理/肝胆相照 审校/王福生院士、徐若男教授
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